Procese de Sterilizare în Biotehnologie

Procesele de creştere a biomasei microbiene impun, în marea lor majoritate, absenţa totală a sporilor de microorganisme străine, provenite din apă, aer sau materii prime, care s-ar putea dezvolta în faza de fermentaţie, infectând cultura unică a microorganismului util. Această cerinţă tehnologică se poate realiza prin sterilizare şi, mai rar, prin pasteurizare.

Sterilizarea este, prin urmare, procesul prin care are loc distrugerea sau îndepărtarea microorganismelor patogene sau apatogene (atât a formelor vegetative, cât şi a sporilor) din substanţe, preparate, spaţii închise, obiecte etc. Pasteurizarea reprezintă operaţia care constă în distrugerea microorganismelor, inclusiv a bacteriilor, prin încălziri repetate sub 100OC.

În industria de biosinteză, unde se obţin culturi microbiene pure, precum şi în industria farmaceutică şi cea alimentară, procesul de sterilizare este de neînlocuit şi poate fi realizat, de obicei, prin:

a) metode termice:

- sterilizare cu aer cald la 140 - 200°C;

- sterilizare cu vapori de apă sub presiune la 120 - 140°C;

- sterilizare prin încălziri repetate la 70 - 100°C.

b) metode fizice:

- filtrare prin umpluturi fibroase;

- filtrare prin materiale poroase;

- filtrare prin membrane;

- utilizarea radiaţiilor UV, IR, raze X, β, γ etc.

c) metode chimice:

- utilizarea agenţilor chimici: oxid de etilenă, formaldehidă, fenol, azotiperită, ozon etc.

d) metode de preparare pe cale aseptică.

Sterilizarea termică uscată include şi sterilizarea prin flambare, folosită în faza de însămânţare a inoculului şi a prelevării probelor. Acest gen de sterilizare constă în trecerea probelor sau a obiectelor prin flacără, timp de câteva secunde.

În general, metoda de sterilizare se alege în funcţie de proprietăţile fizico-chimice ale materialelor supuse sterilizării, astfel încât să se evite modificările calitative ale acestora.

Între încălzirea uscată şi încălzirea umedă, în procesul de sterilizare prin metoda termică, există o deosebire importantă, ultima având o eficienţă sporită. Fenomenul se explică prin acţiunea hidratantă, coagulantă şi hidrolizantă a apei şi a aburului asupra proteinei microbiene. Comparând performanţele sterilizării prin încălzire uscată şi umedă (tabelul 2.1.), se constată că sterilizarea cu aer cald necesită temperaturi şi durate mult mai mari.

Din aceste motive, în tehnică se preferă sterilizarea umedă, care poate fi urmărită în funcţie de punctul termic mortal şi timpul termic mortal. Punctul termic mortal este definit prin valoarea temperaturii la care sunt omorâte toate celulele unei anumite specii, în timp de 10 minute. Timpul termic mortal reprezintă acea valoare a timpului de expunere la o anumită temperatură necesară distrugerii tuturor celulelor sporulate.

Tabel 2.1. Parametrii sterilizării prin încălzire uscată (cu aer cald) şi umedă (cu abur sau apă fierbinte)

Denumire microorganism Încălzire uscată Încălzire umedă

Tempera¬tura, °C Timp Tempera¬tura, °C Timp

Salmonella typhi 100 30 min 65 20 s

Mycobacterium tuberculosis 100 45 min 65 10 s

Staphylococcus pyogenes 120 30 min 65 60 s

Spori fungici 120 90 min 80 30 min

Spori de Bacillus anthracis 170 10 min 100 10 min

Spori nativi din sol 180 30 min 120 30 min

După cum se observă din tabelul 2.2, pentru sporii unor anumite microorganisme, timpul termic mortal scade semnificativ odată cu creşterea temperaturii, ceea ce conduce la concluzia că trebuie ales regimul de sterilizare rapid la temperaturi mai ridicate. În acest mod, se asigură un grad sporit de siguranţă în sterilizare şi o conservare mai bună a calităţilor nutritive ale mediului de cultură.

Tabelul 2.2. Timpul termic mortal pentru sporii unor microorganisme în sterilizarea termică umedă

Spori Temperatura, °C

80 100 110 120

Bacillus subtilis 74 - 75 h 175 min 37 min 7,5 - 8 min

Bacillus fusiformis 10 - 10,5 h 40 - 45min - -

Bacillus mycoides 7,5 - 8 h 10 min - -

Bacillus megaterium 16 - 17 h 15 - 16 min -

Bacillus cylindricus - 20 h

Clostridium botulinum - 5,5 h 32 min 4 min

Clostridium sporogenes - 10 h 90 min 15 min

În concluzie, studiul bazelor termodinamice ale sterilizării termice reprezintă singurul criteriu concret în alegerea condiţiilor de realizare a acestui proces.

Sterilizarea prin filtrare pe materiale poroase se utilizează frecvent în cazul preparatelor termolabile. Procedeul este preferat şi atunci când preţul prea mare al energiei şi cheltuielile pentru aparatură exclud îndepărtarea microorganismelor prin metoda termică. În procesul de sterilizare prin filtrare se folosesc filtre poroase Jena G5, filtre de azbest-celuloză (denumite filtre Seitz sau Filtrasic), filtre cu membrană, filtre de profunzime şi filtre absolute.

Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilor, deşi prezintă unele neajunsuri, este aplicată din ce în ce mai mult în industrie, atât pentru sterilizarea produselor, cât şi a aerului din boxele sterile.

În afara filtrării, pentru sterilizarea unor produse sau materii prime termolabile, se poate utiliza procedeul sterilizării la rece cu etilenoxid, formaldehidă, fenol, amestec aer-formaldehidă etc. Pentru substanţe mai puţin termolabile se recomandă combinarea sterilizării termice cu cea chimică (sunt utilizate astfel de procedee combinate, care folosesc acidul 5-nitrofenil-acrilic, formaldehida, apa oxigenată).

Prepararea produselor pe cale aseptică se utilizează atunci când nu este posibilă sterilizarea lor prin procedeele prezentate anterior. Tehnologia preparării aseptice se realizează în boxe sterile, aerul din acestea fiind sterilizat prin filtrare, iradiere sau cu agenţi chimici. În ultima perioadă a fost extins la scara industrială sterilizarea aerului din boxe prin curgere peliculară, controlul sterilităţii aerului făcându-se cu ajutorul filtrelor cu membrană.

Pentru industria de biosinteză, procesele de sterilizare a mediului de cultură, a aerului tehnologic, a sistemelor de transvazare şi a instalaţiilor care deservesc tehnologia respectivă constituie probleme determinante în obţinerea unor culturi pure de microorganisme, respectiv în atingerea unor performanţe tehnologice sporite, redate prin intermediul randamentului în produs util.