Microbiologie

Metodele de evaluare a populaţiilor microbiene

metode directe, care permit evaluarea concentraţiei de celule sau a biomasei sau metode indirecte, în care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat în corelaţie cu conţinutul de biomasă (turbiditatea mediului cultivat, fluorescenta, impedanţa);

metode nonculturale, care permit evaluarea rapidă a populaţiei microbiene analizate şi metode culturale, care necesită o perioadă de incubare pentru creşterea coloniilor şi stabilirea rezultatului analizei;

metode automatizate, "on line", care permit analiza directă a probelor din fermentator, sau metode care necesită prelevarea aseptică de probe pentru analiză.

Tehnici de diluare

Serii liniare, în care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie aritmetică (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) şi care sunt puţin utilizate;

Serii logarítmice (diluţii decimale), în care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie geometrică (ex. 0.1/0.01/0.001/0.0001 etc.).

Pentru realizarea diluţiilor decimale, într-un număr de eprubete sterile egal cu numărul de diluţii necesar a se efectua, se pipetează aseptic 9 cm3 de lichid de diluţie (ser fiziologic steril, apă distilată sterilă, mediu Ringer - pentru Escherichia coli).

Tehnici de concentrare

utilizate în special pentru punerea în evidenţă a microorganismelor patogene;

Metode de îmbogăţire, care presupun inocularea probei de analiză într-un mediu favorabil pentru multiplicarea rapidă a celulelor aflate în concentraţii reduse în proba de analizat şi, după termostatare în condiţii optime de cultivare, se verifică prezenţa sau absenţa microorganismelor analizate, fără o determinare efectivă a concentraţiei de celule;

Metode de separare fizică sau fizico-chimică a celulelor prin filtrare, centrifugare, floculare, sedimentare, în care se determină concentrarea celulelor pe unitatea de volum, ceea ce asigură posibilitatea evidenţierii lor ulterioare prin tehnici directe sau culturale;

Metode de separare prin interacţiuni hidrofobe-hidrofile, interacţiuni ale sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine.

I.

NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR PRIN EXAMEN MICROSCOPIC DIRECT

I.1. Numărarea cu citometre

Celulele de drojdii şi sporii de mucegai se pot număra, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor

Un citometru este o lamă de sticlă groasă, prevăzută cu trei platforme separate între ele prin rigole în sticlă. Platforma centrală este denivelată faţă de celelalte două cu o înălţime de 0,1- 0,2 mm (înscrisă pe fiecare cameră). Pe platforma centrală este gravată o reţea de linii perpendiculare, care delimitează o anumităsuprafaţă divizată de către linii perpendiculare în microcelule de formă pătratică (pătrăţele elementare). Diferenţierea dintre tipurile de citometreconstă în mărimea variabilă a suprafeţei unui pătrăţel elementar. În cazul citometrului Thoma, suprafaţa de 1 mm2 este divizată în 400 de pătrăţele elementare cu latura de 1/20 mm

Numărul de celule prezente într-un cm de suspensie de analizat se de­termină cu formula:

N = n·4 · 106 ·k

în care: N este numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar; k - coeficient de diluţie.

În cazul bacteriilor, această metodă este greu de aplicat, atât din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor cât şi a faptului că de multe ori ele prezintă mobilitate.