Biologie Celulară

Lucrarea de laborator 1

Separarea componentelor celulare

Noţiunea de component celular are o semnificaţie largă, ea desemnând atât structurile celulare organizate, cu semnificaţie funcţională (organite celulare), substanţele de rezervă şi depozit ale celulei (incluziuni celulare), cât şi macromoleculele, micromoleculele şi ionii ce definesc compoziţia chimică a celulelor.

Separarea componentelor celulare reprezintă atât un scop experimental în sine, dar este şi o etapă iniţială şi obligatorie necesară studiului ulterior al acestor componente, prin variate mijloace de investigaţie.

Dintre diversele metode de separare a componentelor celulare (cu diferite niveluri de com¬plexitate) aplicate în prezent în diferite laboratoare, se pot enumera:

• separarea pe cale chimică;

• electroforeza;

• cromatografia;

• centrifugarea şi ultracentrifugarea etc.

În vederea separării componentelor celulare, prin oricare dintre metodele enumerate, este însă necesar ca, într-o primă instanţă, integritatea morfostructurală a celulelor intacte să fie alterată, pentru ca aceste componente celulare să fie puse în libertate; trebuie deci practicate o serie de tehnici, desemnate global sub numele de omogenizare (omogenare) celulară.

1.1. Omogenizarea şi omogenatele celulare

Simplificat, noţiunea de „omogenizare” poate fi definită ca operaţia (operaţiile) prin care se obţine un omogenat celular.

Omogenatul celular este o suspensie de celule întregi (sau de componente subcelulare), realizată într-un mediu lichid cu două caracteristici esenţiale: pH fiziologic şi izotonicitate.

Există mai multe metode de realizare a omogenatelor celulare, care, în funcţie de factorul principal ce determină dezorganizarea celulelor (sau detaşarea celulelor întregi dintr-un ţesut), se pot clasifica în:

1.1.1. Metode mecanice de omogenizare.

Există mai multe tipuri de metode mecanice de omogenizare, dintre care se pot enumera următoarele:

• omogenizarea cu ajutorul omogenizatorului Potter, dispozitiv ce prezintă următoarele componente (Fig. 1.1):

Datorită spaţiului foarte îngust dintre peretele interior al cuvei şi extremitatea îngroşată a pistilului celulele sunt supuse unei acţiuni de triturare mecanică, produsă prin rotaţia pistilului; membrana celulară cedează sub acţiunea forţei rotative, iar componentele celulare, chiar de dimensiuni mari, sunt eliberate în mediul de omogenizare, obţinându-se astfel un omogenat celular.

Fig. 1.1. Schema unui omogenizator de tip Potter

• omogenizarea cu ajutorul omogenizatorul Warring (cu cuţite) (Fig. 1.2.)

Fig.1.2. Reprezentarea schematică a extremităţii inferioare a pistilului omogenizatorului Warring

Datorită lamelelor semicirculare cu care este prevăzut pistilul acestui omogenizator, se ob¬ţine o omogenizare mai avansată a celulelor, rezultând, în general, suspensii de com¬po¬nen¬te celulare mai fine decât în cazul metodei Potter.

• prin mojarare, cu sticlă pisată (sau nisip de cuarţ)

Această metodă este considerată cea mai agresivă variantă mecanică de o¬mo¬ge¬ni¬za¬re, datorită acţiunii abrazive a particulelor de sticlă asupra celulelor; ea conduce la eliberarea de a¬gregate moleculare întregi, în mediul de omo¬ge¬ni¬za¬re, din ansamblul unor organite celulare.