Studiul comparativ privind locusul de înserare al genei PLN la tulpina de L. Plantarum

1. Introducere

Unele tulpini de bacterii lactice (LAB) au capacitatea de a produce bacteriocine. Bacteriocinele constituie un grup heterogen de peptide si proteine antimicrobiene, care sunt active impotriva microorganismelor din aceeasi specie sau bacterii inrudite (Klaenhammer, 1998). Au fost indentificate diferite clase de bacteriocine LAB pe baza caracterizarilor biochimice si genetice (Cotter si colab., 2005; Diep si Nes, 2002). Locusul de inserare al genei pln al L. plantarum C11 (Diep si colab., 1996) este cel mai bine caracterizat din cei 5 operoni inclusi. Operonul reglator (pln ABCD) codifica o bacteriocina inductoare cum ar fi peptida (PlnA), o proteina histidin-kinaza (PlnB) si doua secvente reglatoare citoplasmatice (PlnC si PlnD). Un alt operon (plnGHSTUV) asociat cu transportul, si cei 3 operoni ramasi (plnJKLR, plnMNOP, pnlEFI) sunt legati cu productia de plantaricina si de imunitate (Anderssen si colab., 1998; Diep si colab., 1996). O alta organizare a locusului pln a fost observata pentru L.plantarum NC8 (Maldonado si colab., 2003), care include operoni similari lui L.plantarum C11, precum si unele gene care codifica, un factor peptidic de inductie (PLNC8IF), o histidin kinaza (PLN8HK) si secventa de reglare PlnD (Maldonado si colab., 2004). Recent, un nou locus pln al L. plantarium J23 a fost descsris de catre grupul nostru de cercetare. Sistemul de reglemantare, un presupus operon care include 3 noi orfs, precum si repertoriul responsabil al bacteriocinelor locusul J23 pln prezinta diferente importante cu privire la celalalt locus pln (Rojo-Bezares si colab., 2008).

Tulpina L.plantarum J51 a fost izolata dintr-un vin rosu de calitate La Rioja (Spania) sub fermentatie spontana malolactica. Aceasta tulpina a demonstrat capacitatea de a produce bacteriocine impotriva unei game largi de LAB de interes oenologic si a fost efectuata caracterizarea ei biochimica (Navarro si colab., 2000). Aceste caracteristici au conferit lui L.plantarum J52 un mare interes atat in microbilogia vinului cat si in studiul productiei de bacteriocine. Obiectivul acestui studiu a fost de a prezenta caracteristicile genetice ale locusului J51 pln, si de a realiza un studiu comparativ cu alt sistem pln raportat anterior.

2. Materiale si metode

2.1 Tulpinile folosite in acest studiu

Tulpina de L.plantarium a fost recuperata dintr-o proba de vin din regiunea La Rioja (Spania) in perioada de recoltare anul 1999, si a fost testata pentru activitatea antimicrobiana in publicatia anterioara de catre Navarro si colab.,( 2000), alegand L.hilgardii J81 ca cea mai buna tulpina indicatoare. Aceste tulpini au fost crescute la 30° C in placute MRS (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spania) in conditii anaerobe.

Fig. 1. Harta genetica a locusurilor de inserare a genei pln la diferite tulpini de L. plantarium. Genele pln sunt reprezentate de sageti cu diferite culori corespunzatoare fiecarui operon. Secventele de promotori sunt indicate de mici sageti negre si presupusa secventa de promotor a noului operon este indicata prin sageti mici negre si discontiunue.

2.2. Efectul cantitatii de inocul asupra ratei de crestere si a productiei de bacteriocine

A fost studiat efectul inoculului initial si cresterea curbei productiei de bacteriocine a L. plantarium J51. L.plantarium J51, cultivat la 30° C in bulion MRS, de diferite concentratii de celule (108, 107, 106, 105 si 104 UFC/ml). Probe au fost luate la fiecare 2 h pentru determinarea DO 600 si pentru testarea bacteriocinelor. Probele au fost centrifugate la 17,900× g de 3 ori inaintea testarii bacteriocinelor pentru obtinerea esantioanelor de celule libere, care au fost folosite pentru testul de difuzie in agar descris de Rojo-Bezarea si colab., (2007); ca tulpina indicator pentru detectia de bacteriocine a fost utilizata L.hilgardii J81.

2.3 Extractia ADN

Valoarea totala a genomului ADN al L.plantarum J51 a fost obtinut dintr-o cultura proaspata de tulpina, folosind sistemul InstaGene ™ Matrix sistem (Bio - Rad, Hercules, CA, SUA), folosind instructiunile producatorului.

2.4. Caracterizarea genetica a lucusului de inserare a genei pnl a L.plantarum J51

Pentru a amplifica locusul de inserare al genei pln al L. plantarum J51, au fost conceputi primeri variati, folosind softul Beacon Designer de la Premier Biosoft International, bazat pe lucusul cunoscut de inserare al genei pln al L. plantarum C11 (GenBank de aderare nr. X94434), L.plantarum NC8 ( AF522077), si L.plantarum J23 (DQ 323671). Strategia PCR “primerwalking” a fost utilizata pentru a amplifica fragmentele suprapuse si pentru a determina secventa completa. Ampliconii obtinuti au fost secventiati cu ajutorul Genome Express Service (France). Toate analizele PCR si produsele de secventiere au fost efectuate