Culturi de Celule

IZOLAREA ŞI SORTAREA CELULARĂ

Majoritatea tehnicilor de analiză biochimică presupun izolarea celulelor din contextul lor tisular. În acelaşi timp, pentru o analiză cantitativă şi calitativă coerentă, este necesar un număr relativ mare de celule. Dacă pornim investigaţia de la un fragment de ţesut, problema întâmpinată constă în faptul că acest fragment conţine un număr mare de specii celulare amestecate. Este deci necesară extragerea diferitelor specii celulare urmată de o sortare în funcţie de diferite criterii; dacă numărul de celule este satisfăcător, se poate trece la destructurarea celulară în vederea analizei conţinutului; dacă numărul de celule este insuficient, se poate proceda la multiplicarea acestora în cadrul unor culturi celulare, din care vor fi prelevate mostre pentru o analiză ulterioară.

Izolarea celulară din ţesuturi

Cele mai accesibile ţesuturi animale pentru izolare celulară sunt cele fetale sau neonatale, în care dinamica şi multiplicarea celulară sunt accentuate iar stabilitatea joncţiunilor intercelulare ca şi cantitatea de matrice extracelulară sunt reduse. Desigur, celulele izolate trebuie să-şi păstreze viabilitatea fie că este vorba de o tentativă exploratorie fie că vor fi supuse cultivării ulterioare.

Primul pas în vederea izolării celulare este reprezentat de denaturarea conexiunilor intercelulare şi a liantului reprezentat de matricea extracelulară. Joncţiunile intercelulare sunt dependente de prezenţa ionilor de Ca. Astfel, un chelator (agent de îndepărtare) al calciului cum este EDTA (acid etilen-diamino-tetra-acetic) aplicat fragmentului de ţesut de investigat, va determina desfacerea joncţiunilor menţionate, cu eliberarea celulelor. Matricea extracelulară (incorect denumită anterior – substanţă fundamentală) poate fi denaturată prin tratamentul fragmentului tisular cu enzime proteolitice ca tripsina sau colagenazele (al căror rol este de a digera componentele ale matricei extracelulare cum ar fi colagenul sau proteoglicanii). După tratarea unui fragment tisular prin tripsinizare (cu tripsină) şi EDTA, de obicei este suficientă o uşoară agitare a eşantionului pentru a disocia celulele viabile. În eprubeta de lucru se obţine o mixtură celulară, formată din celule izolate, în suspensie.

Al doilea pas este separarea şi sortarea celulelor în suspensie, obţinute prin izolarea din ţesuturi. Procedurile de separare implică metode fizice, cum ar fi centrifugarea, care va fi descrisă la metodele de separare a organitelor celulare, pentru care a fost iniţial concepută. Alte proceduri de separare se bazează pe capacitatea celulelor de a adera mai mult sau mai puţin la diferite tipuri de suprafeţe (sticlă sau plastic).

Una din cele mai interesante tehnici de sortare este bazată pe posibilitatea utilizării anticorpilor specifici. Aceşti anticorpi (proteine specifice sintetizate de celulele sistemului imun, ca răspuns la structuri non-self) pot fi ataşaţi la suprafaţa celulelor, în mod diferenţial şi pot interacţiona adeziv cu diferite suporturi organice (colagen, polizaharide, microsfere de plastic. Aceste suporturi organice formează o suprafaţă de afinitate la care celulele marcate cu anticorpi vor adera. După aderare, celulele pot fi desprinse fie prin agitare uşoară, tratament cu tripsină (tripsinizare) pentru a denatura proteinele care au mediat fenomenele de adezivitate sau tratament cu enzime care denaturează substratul de tip matriceal (colagenul pentru care utilizăm o colagenază).

Una din tehnicile cele mai avansate de sortare a celulelor utilizează cuplarea cu anticorpi urmată de marcajul fluorescent al acestora. Celulele marcate astfel (cu anticorpi marcaţi la rândul lor cu fluoroforul specific) sunt separate de un sistem de sortare prin activarea fluorescenţei. Celulele marcate circulă prin acest sistem de sortare (fig. …) în flux laminar iar fluorescenţa fiecărei celule este măsurată precis. Un subansamblu de sonicare formează picături microscopice care conţin câte o celulă sau nu conţin de loc celule. Aceste picături microscopice sunt încărcate pozitiv sau negativ în momentul formării, în funcţie de pozitivitatea sau negativitatea fluorescenţei. Apoi, picăturile trec printr-un câmp electric care le deviază traiectoria în funcţie de încărcarea electrică. Astfel, picăturile cu încărcare pozitivă (şi care conţin celule marcate fluorescent) sunt depozitate într-un recipient fiind separate de cele încărcate negativ. Particulele şi picăturile neîncărcate îşi continuă parcursul în mod gravitaţional, ajungând în recipientul de deşeuri. Astfel de sisteme de sortare au o capacitate de 5000 de celule pe secundă.

Celulele obţinute prin această metodă de sortare pot fi supuse direct analizelor biochimice sau pot fi direcţionate spre alte metode de multiplicare celulară – culturi tisulare şi stabilizarea de linii celulare.

Culturi tisulare şi celulare

Prin definiţie, culturile tisulare reprezintă totalitatea tehnicilor de menţinere şi în unele situaţii de creştere şi multiplicare in vitro a unor mici fragmente tisulare extrase de la plante sau animale. Culturile tisulare sau celulare sunt necesare pentru studiul efectelor unor substanţe endogene sau exogene asupra sistemelor vii. Culturile de ţesut sunt utilizate pentru a iniţia culturi celulare.

Istoric

1881 – Roux a demonstrat viabilitatea celulelor de la embrionul de găină într-o soluţie salină şi în afara unui organism viu

1907 – Harrison rezolvă controversa „doctrinei neuronale” care susţinea că extensiile neuronale se dezvoltă prin evoluţia corpului neuronal şi nu prin fuziunea celulelor care înconjură aceste extensii. El a cultivat fragmente de măduvă spinală de amfibian (ex. broască) pe cheag limfatic şi a demonstrat că extensiile neuronale se dezvoltă pornind de la corpul neuronal şi invadând suportul nutritiv.

1913 – Carrel demonstrează că unele celule pot creşte şi supravieţui pentru un timp în cultură dacă sunt alimentate corespunzător şi menţinute într-un mediu aseptic.

1948 – Earle şi colab. izolează celule din linia L şi determină formarea de clone celulare în cultură de ţesuturi.

1952 – Gey şi colab. stabilizează prima linie celulară din carcinomul cervical uman, linie cunoscută astăzi sub numele HeLa.

1961 – Hayflick şi Moorehead arată că numeroase fibroblaste mor după un număr determinat de diviziuni în cultură.

1964 – Littlefield introduce mediul HAT în vederea creşterii selective a hibrizilor de celule somatice. Odată cu punerea la punct a tehnicilor de hibridare a celulelor a fost deschisă era manipulării genetice.