Etapele unui Proces Biotehnologic

Elaborarea şi industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea mai multor faze constând în cercetări la nivel de: laborator, pilot şi industrial. Aceste cercetări permit transpunerea procedeului de biosinteză de la o fază la alta.

1. FAZA DE LABORATOR

Cercetările de obţinere a unui produs prin biosinteză încep cu lucrări de laborator care sunt prezentate în cele ce urmează.

Izolarea şi selecţia. Se izolează şi se selectează un mare număr de microorganisme cunoscute din literatura de specialitate ca producători ai compusului ce urmează a fi biosintetizat. Tehnicile utilizate în acest scop sunt specifice pentru fiecare microorganism şi sunt realizate de microbiologi cu pregătire corespunzătoare. Manualele de specialitate indică mai frecvent, pentru izolarea şi selecţia microorganismelor, metode ca: tehnica diluţiilor şi tehnica granulelor de sol.

Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau lichide, astfel încât să fie posibilă punerea în evidenţă a unor caracteristici fiziologice. In prima etapă se urmăreşte realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice (epuizarea ansei, diluţii succesive etc.). în continuare se stabileşte o metodă de triere (screening) adecvată scopului urmărit.

De obicei, microorganismele sunt cultivate pe plăci Petri, pe medii solidificate cu agar-agar. Testele de identificare a compusului care interesează pot "fi calitative sau cantitative. în cazul enzimelor, de exemplu, se aplică, de obicei, metode de identificare calitativă prin includerea în mediul solid, pe care se cultivă microorganismele, a substratului specific asupra căruia acţionează enzima ce se doreşte a se sintetiza (amidon în cazul amilazelor, caseină în cazul proteazelor, celuloză în cazul celulazelor). După dezvoltarea coloniilor izolate, enzimele difuzează în gelul de agar-agar, atacând substratul inclus în mediu şi, astfel, zona respectivă poate fi vizualizată, în cazul în care devine transparentă sau cu un reactiv specific.

în cazul altor enzime la care nu se poate aplica un test calitativ, coloniile izolate se cultivă pe medii specifice, iar extractul sau lichidul de biosinteză este preluat şi prelucrat în scopul dozării cantitative a acesteia prin metode spec-trofotometrice, fluorescentă, titrimetrice, polarimetrice. în urma acestor teste se reţin numai câteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate în ceea ce priveşte biosinteză enzimei.

întreţinerea tulpinilor producătoare. După faza de izolare şi selecţie, tulpinile producătoare se supun unor lucrări de caracterizare după criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice, toxicologice. Tulpina astfel caracterizată se înregistrează într-o colecţie de microorganisme sub un număr de identificare. De obicei, aceste tulpini sunt supuse unor lucrări de selecţie naturală şi artificială (mutageneză) în scopul obţinerii de tulpini mutante înalt producătoare.

Atât tulpinile parentale cât şi tulpinile mutante sunt conservate prin metode speciale şi păstrate la temperaturi scăzute. Dintre metodele de conservare amintim: liofilizarea şi conservarea în azot lichid.

Tulpinile din colecţie utilizate în lucrările de biosinteză curente se păs¬trează sub diferite forme, după metode de întreţinere a culturilor, specifice fiecărui microorganism şi formează aşa-numita „cultură stoc" de la care se porneşte procesul de biosinteză.

De obicei, cultura stoc este păstrată la frigider, pe geloză nutritivă, în tub înclinat. Pentru prepararea unei culturi inocul de laborator, se porneşte de la o astfel de cultură vegetativă.

Cultura de inocul. Inoculul reprezintă o cultură microbiana în curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunzător şi în anumite condiţii specifice de dezvoltare (pH, temperatură, agitare, aerare).

Inoculul constituie materialul de însămânţare al mediului de biosinteză propriu-zis, din etapa următoare.

Transvazarea culturii inocul în mediul de biosinteză se realizează în condiţii aseptice, după o perioadă de dezvoltare bine stabilită de către microbiolog (vârstă, cantitate, aspect microscopic). în figura 1 poate fi urmărită o instalaţie de laborator {shake-flask cultures) pentru .producerea de enzime existente în cadrul Facultăţii de Biotehnologii, Bucureşti.

Fig. 1. Instalaţie de laborator cu flacoane agitate pentru obţinerea enzimelor prin fermentaţie.

2. FAZA DE STAŢIE PILOT

Faza de biosinteză propriu-zisă se realizează în aparate speciale, numite bioreactoare de diferite capacităţi (10 1, 100 1, 1 m3, 10 m3, 100 m3), fiind precedată de operaţii de sterilizare a aparaturii utilizate şi a mediului de cultură stabilit, la nivel de laborator, ca fiind optim. începutul fazei de biosinteză este considerat momentul transvazării culturii inocul în mediul de cultură sterilizat şi răcit la temperatura de cultivare a microorganismului producător. Când raportul între capacitatea de inocul şi cantitatea de mediu de fermentaţie (numit raport de inoculare) nu permite pregătirea culturii inocul în laborator, este necesară intro¬ducerea unei trepte intermediare de cultivare, numite „cultură intermediară".

în faza de staţie pilot, tehnologia elaborată la nivel de laborator este verificată şi optimizată pe instalaţii de biosinteză de capacitate medie (pilot). în figura 2, se poate vedea un echipament micropilot (bioreactor de tip „Biotech Braun" de capacitate 5 1), utilizat pentru producţia de enzime (Facultatea de Biotehnologii, Bucureşti).

Pe baza datelor de cercetare obţinute la nivel pilot, se elaborează aşa-numitul „proces tehnologic pilot" care urmează o fază de experimentare industrială şi apoi producţia propriu-zisă de enzimă.