Ingineria Drojdiilor

C A P. 6. T E H N I C I d e I N G I N E R I E G E N E T I C Ă l a D R O J D I I

Drojdiile prezintă numeroase avantaje care le recomandă ca model experimental în ingineria genetica şi biotehnologie. În primul rând, levurile prezintă un timp scurt de multiplicare şi apariţie a unei noi generaţii, de aproximativ 2 ore, ceea ce permite obţinerea a mii de colonii de drojdii , în numai 2 zile, prin cultivare pe plăci Petri, pe un mediu relativ simplu. În al doilea rând, genomul de S. cerevisiae are dimensiuni relativ reduse (1,4 x 107 pb) faţă de cel mamalian (3,5 x 109 pb), ceea ce simplifică analizele genetice şi moleculare. În al treilea rând, drojdiile reprezintă un material optim pentru analizele genetice deoarece pot fi menţinute atât în stadiu haploid cât şi în stadiu diploid. Astfel, mutaţiile genetice recesive pot fi relativ uşor obţinute şi exprimate în celulele haploide, iar complementaţia genetică poate fi realizată prin simpla împerechere a două mutante haploide.

Ingineria genetică la drojdii, ca de altfel şi la alte organisme, cuprinde 2 tehnologii: tehnologia ADN recombinant - inginerie genetică moleculară şi fuziunea de protoplaşti –inginerie genetică celulară.

Primele experimente de inginerie genetică moleculară (transformare genetică) cu drojdii au fost realizate de Hinnen şi Beggs (1978) care au demonstrat posibilitatea clonării şi exprimării genelor heterologe în celula de Saccharomyces cerevisiae. Până în prezent au fost construiţi numeroşi vectori atât pentru tulpinile de drojdii de laborator, având o aplicabilitate mai mult teoretică, cât şi pentru tulpinile de drojdii industriale în scopul ameliorării productivităţii acestora.

Vectori, markeri genetici si procedee de transformare genetica

Vectorii utilizabili la drojdii pot fi clasificaţi în funcţie de posibilitatea de clonare şi / sau exprimare a genelor heterologe în:

-vectori de clonare – care permit numai clonarea fragmentelor de ADN heterolog;

-vectori de exprimare – care permit exprimarea prin transcrierea ADN heterolog clonat datorită prezenţei unor promotori foarte puternici constitutivi, inductibli sau hibrizi;

-vectori de secreţie – care permit secreţia produşilor genelor clonate datorită prezenţei unor peptide semnal, reprezentate, de regulă, prin peptida semnal a precursorului factorilor de împerechere a sau α şi cea a factorului killer.

Toate aceste tipuri de vectori prezintă, în comun, ca bază de construcţie, un fragment dintr-un vector pentru celule bacteriene (pBR322, pUC118/119, pUC18/19, pBluescript SK/KS +/-). Acest fragment asigură o origine de replicare pentru amplificarea vectorului în celula bacteriană, o genă de selecţie a transformanţilor în populaţia bacteriană (gena pentru rezistenţă la ampicilină este cel mai des întâlnită) şi, în unele cazuri, origini de replicare caracteristice fagilor filamentoşi care permit obţinerea de ADN monocatenar şi casete care fac posibilă transcrierea in vitro a fragmentului clonat (pentru vectori bazaţi pe fagimidul pBluescript SK/KS +/-).

Toţi vectorii utilizabili în drojdii prezintă şi markerii genetici selectabili în celula de drojdie. Acestea sunt gene ce codifică enzime implicate în căile metabolice ale unor amionoacizi sau nucleotide (Tab.1). Primul marker genetic de acest tip a fost gena LEU 2 care codifică pentru β-izopropilmalat dehidrogenaza şi care este capabilă să complementeze mutaţia leuB de la Escherichia coli, mutaţie care se exprimă prin deficienţă în aceeaşi enzimă a celulelor bacteriene.

Tab.1 Markeri selectabili utilizaţi pentru drojdii

Gena

Enzima

Selectia

HIS3

imidazol glicerofosfat dehidrogenaza

histidina

LEU2

β-izopropilmalat dehidrogenaza

leucina

LYS2

α-aminoadipat reductaza

lizina

TRP1

N -5’fosforibozil-antranilat izomeraza

triptofan

URA3

Orotidin-5’-fosfat decarboxilaza

uracil

Principalele clase de vectori de clonare:

În funcţie de stabilitate şi modul de transmitere în descendenţă în celulele de levuri, se pot defini două clase majore de vectori de clonare (Fig.6. 1):

- vectori integrativi;

- vectori cu replicare autonomă.

Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetică la Drojdii

ADN de drojdieLEU2ADN de drojdieARSADN de drojdieLEU2

2

CEN

Fig. 6. 1. Principalele clase de vectori de clonare pentru drojdii.

pBR322 - secvenţă provenită din plasmidul pBR322; conţine gene pentru rezistenţă la antibiotice (ampicilină şi/sau tetraciclină) şi oriColE1 (pentru replicare autonomă în celula bacteriană);

LEU2 - gena pentru prototrofie la leucină; ADN drojdie - secvenţă din genomul de drojdie;

ARS - secvenţa ARS cromosomală sau din plasmida 2 μm (pentru replicare autonomă în drojdii); CEN - secvenţă centromerică dintr-un cromosom de drojdie;

secvenţă extinsă din plasmida 2 μm care conţine secvenţa ARS, REP1, REP2, REP3 (STB ) şi, de cele mai multe ori, FLP.

Vectori de clonare

A. Vectorii integrativi (YIp = Yeast Integrating plasmids) – conţin markeri selectabili pentru drojdii, dar nu prezintă secvenţe care să permită replicarea autonomă a vectorilor în celula de drojdie. Transformarea celulei de drojdie are loc în urma unui proces de integrare al plasmidei în genomul drojdiei prin recombinare omoloagă între o secvenţă din cadrul plasmidei şi regiunea corespunzătoare de la nivelul unuia dintre cromozomii drojdiei. Eficienţa transformării cu vectorii YIp este de numai 1 – 10 transformanţiμg ADN.

În Fig. 6. 2 este reprezentat un vector din aceasta clasă - YIp 5. Vectorul prezintă:

- genele de rezistenţă la ampicilină şi tetraciclină (ApR, TcR) care permit selecţia transformanţilor (ampicilină rezistenţi- tetraciclină sensibili);

- originea replicării din plasmidul ColE1 (oriColE1) conferă capacitate de replicare autonomă în celula bacteriană;

- tulpinile de drojdie receptor sunt auxotrofe pentru uracil (ura3). Transformarea celulelor de drojdie are loc prin integrarea vectorului la nivelul secvenţei URA3 la locusul de omologie din cromosomul de drojdie, celulele transformate revenind la starea de prototrofie pentru uracil.