Inginerie Genetică

CAPITOLUL II

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

Tehnologia ADN recombinant se referă la metodologia obţinerii moleculelor de ADN recombinant, adică de realizare "in vitro" a unor molecule de ADN noi prin îmbinarea de fragmente provenite fie din genomul unor specii biologice diferite, fie de la aceeaşi specie. Imbinarea respectivelor fragmente se realizează într-o ordine diferită de cea naturală, astfel încât elementele genetice utilizate capătă o structură aparte, conferind organismului în care sunt introduse proprietăţi noi pe care nu le-ar dobândi pe cale naturală.

Aşa cum s-a prezentat anterior (fig.1), pentru a obţine moleculele de ADN recombinant este necesar să se parcurgă mai multe etape care pot fi sintetizate astfel:

1. izolarea genelor naturale sau sinteza chimică a unor molecule de ADN ce codifică proteinele dorite;

2. selecţia unui vehicul sau vector adecvat care să transporte genele respective şi apt să se replice autonom în celula receptoare;

3. inserţia genelor străine în structura genetică a moleculei vector şi obţinerea unei himere moleculare;

4. introducerea acesteia într-o gazdă specifică şi transformarea ei;

5. asigurarea condiţiilor care permit exprimarea informaţiei străine în celula acceptoare;

6. selectarea celulelor modificate genetic din populaţia celulară rezultată prin multiplicare;

7. evidenţierea produsului genei în celulele modificate sau în mediul de cultură al acestora şi purificarea lui pentru a fi folosit în scopurile pentru care s-au realizat tehnicile respective.

2.1. Etapele de lucru pentru obţinerea şi selecţia moleculelor recombinate de ADN

Scopul experimentelor de inginerie genetică este acela al obţinerii moleculelor de ADN prelucrate “in vitro” astfel încât ele să conţină genele de interes şi să poată fi transferate în gazde corespunzătoare. Etapele de lucru ce au ca rezultat obţinerea acestor molecule presupun elaborarea unor metode de izolare şi purificare a acizilor nucleici, a utilizării unor enzime specifice şi selectarea unor vectori de clonare adecvaţi.

2.1.1. Izolarea şi purificarea acizilor nucleici

Realizarea experimentelor de clonare a genelor presupune ca etapă de bază purificarea unor diferite tipuri de molecule de acizi nucleici: ADN celular total (din celule vegetale, animale, bacteriene sau din levuri), ADN plasmidial, ADN viral sau ARN. In funcţie de tipul de molecule de acizi nucleici şi de organismul de origine au fost elaborate numeroase metode de izolare şi purificare. Indiferent de metoda utilizată este necesară parcurgerea mai multor etape: obţinerea (cultivarea) materialului biologic; liza celulelor pentru eliberarea acizilor nucleici; îndepărtarea componentelor celulare nedorite (resturi celulare, proteine etc); purificarea acizilor nucleici de interes; concentrarea acizilor nucleici obţinuţi anterior.

2.1.1.1. Izolarea ADN total

Pentru izolarea ADN total se utilizează fie fragmente de ţesuturi (vegetale sau animale), culturi celulare sau suspensii celulare. Indiferent de tipul de celule utilizate în experimente este necesară liza acestora, proces realizat prin metode variate (liza chimică în prezenţa unor soluţii alcaline şi/sau a unor detergenţi; liza enzimatică cu ajutorul unor enzime specifice; liza produsă prin procedee fizice: ultrasonicare, îngheţarea celulelor în azot lichid, metode mecanice etc). Protejarea de acţiunea nucleazelor endogene a ADN liberat prin spargerea celulelor se realizează, de regulă, prin folosirea unor soluţii tampon ce conţin EDTA (reactiv ce leagă ionii de magneziu făcându-i inaccesibili DN-azelor, ai căror cofactori sunt). De asemenea, după îndepărtarea prin centrifugare a resturilor celulare, soluţia apoasă obţinută este supusă unor tratamente suplimentare ce au drept scop degradarea ARN (prin adăugarea RN-azei) sau a proteinelor contaminante (prin folosirea unor proteaze sau prin extracţie cu fenol). ADN este apoi recuperat prin precipitare cu etanol (2-2,5 volume), în prezenţa unor cationi monovalenţi (de exemplu, ioni de sodiu în concentraţie de 0,3M) şi apoi prin centrifugare. Deseori, ADN obţinut este redizolvat în tampon, proces urmat de o nouă rundă de deproteinizare, ceea ce asigură o puritate mai bună preparatului. Dacă este însă necesar un grad foarte ridicat de puritate, soluţia de ADN este supusă ultracentrifugării (în gradient de clorură de cesiu).