Spectometria IR - Metode Electroforetice - Cuplajul On-line

Spectometria in IR: domeniul IR cuprinde radiatiile avand lungimi de unda intre 0,8 – 200um. Exprimat in cm-1, domeniul este cuprins intre 12500 – 50 cm-1.

Regiunile utile dpdv analitic sunt intre 3600 – 300cm-1 in IR si 12500 – 4000cm-1 in IR apropiat.

Cea mai importanta utilizare a spectrometriei de absorbtie IR este la identificarea si determinarea structurii unor compusi. Aceasta metoda se aplica si pentru determinari cantitative, insa in mai mica masura, de exemplu la amestecuri de gaze.

Aparatura: spectofotometrele din IR sunt construite cu dublu fascicul capabil sa elimine efectul produs de vaporii de apa si CO2 din atmosfera.

Partile componente:

Sursa ideala este corpul negru incalzit la aproximativ 1000oC. Se folosesc filamente crom-nichel, filamente Nernst, surse Globar.

Monocromatoarele sunt realizate pe baza de prisme de halogenuri (transparente IR) sau cu retele de difractie avand intre 100 si 25 trasaturi pe mm.

Compartimentul de proba este construit sa accepte probe diverse: solide, lichide, gazoase.

Celulele probelor: probleme apar datorita materialelor din care sunt confectionate. Nu exista un material utilizat pe intreg domeniul IR. Se folosesc halogenuri alcaline, ferestre de siliciu, germaniu, clorura de argint, NaCl, KBr, CaI2, polietilena.

Detectorii: utilizati sunt:

- termocuplele: raspunsul este independent de lungimea de unda si liniar cu intensitatea radietiei;

- detectorii piroelectrici: sunt bazati pe substante feroelectrice (TGS)

- celulele Golay: (mecanism pneumatic)

- termorezistentele: se folosesc pentru probe ce apar pt un timp foarte scurt.

Spectometria IR cu transformata Fourier (FTIR)

Se face pentru inregistrarea rapida a spectrelor IR in special la substantele obtinute prin cromatografie pe coloana. Forma de unda de la iesirea detectorului nu mai este o simpla sinusoida, ci o suprapunere dintr-un numar mare de componente sinusoidale, o interferograma.

Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)

Dpdv practic HPLC difera de cea clasica prin urmatoarele caracteristici:

- se utilizeaza noi faze stationare sau suporti cu o mare omogenitate a marimii si formei particulelor;

- se utilizeaza materiale cu diametrul mic al particulelor;

- se utilizeaza noi procedee de umplere a coloanei;

- se aplica presiuni mai mari asupra fazei mobile;

- se utilizeaza detectori de mare sensibilitate, cu celule de masura avand vol mic.

HPLC nu este limitata la compusii volatili si termic stabili, iar separarea cromatografica se poate realiza prin absorbtie, schimb ionic, repartitie, excluziune sterica sau datorita afinitatii biospecifice a substantelor de separat. Astfel se ofera o paleta foarte larga de analize posibile.

Principiile constructive ale aparaturii utilizate in HPLC:

Sistemul de debitare al fazei mobile: include pompa, filtrul si traductorii de debit si presiune. Pompele folosite sunt de 2 tipuri: de presiune constanta si de debit constant.

Sistemul de injectare al probei: se face cu ajutorul unor bucle de injectare;

Coloanele cromatografice: sunt confectionate din tuburi drepte, calibrate, de otel inoxidabil cu suprafata interioara neteda. Au lungimea de 10 – 25 cm si diametrul interior 4 – 5 mm.

Detectorii cromatografici: trebuie sa aibe raspuns rapid si reproductibil, domeniu larg de raspuns liniar, sensibilitate si stabilitate in timp, sa raspunda la toti componentii din proba;

Detectorii spectrometrici in UV: pot fi cu lungime de unda fixa sau ajustabila. Avantaje: cost redus, stabilitate mare cu temperatura.

Detectorii refractometrici: masoara diferenta dintre indicele de refractie al unui flux de faza mobila si efluentul coloanei;

Detectorii fluorimetrici: sunt selectivi si au o sensibilitate ridicata. Au utilizarea limitata la compusii ce prezinta proprietatea de fluorescenta.

Detectorii electrochimici: au sensibilitate ridicata, utilizarea lor fiind posibila in cazul unor faze mobile, bune conductoare de electricitate.

Analiza calitativa si cantitativa:

Este similara cromatografiei de gaze. De mare eficienta este cuplarea directa a cromatografiei de lichide cu un spectometru de masa sau un spectofotometru FTIR, in acest caz facandu-se si determinarea calitativa a unor compusi neidentificati in prealabil. Pentru o analiza cantitativa este mai indicata elutia izocratica decat elutia cu gradienti, deoarece conditiile de lucru sunt mai reproductibile.

Cromatografia de absorbtie pe coloana (lichid – solid) in acest tip de cromatografie procesul predominant de sorbtie al solutului este absorbtia. Separarea componentilor amestecului de analizat se datoreaza diferentelor in polaritatea acestora. Cu cat o molecula este mai polara, cu atat va fi mai puternic retinuta pe o suprafata polara. Componentii unui amestec sunt eluati in ordinea cresterii polaritatii. Drept faza stationara se folosesc mai ales silicagelul si alumina. Puterea de elutie a unui solvent este determinata de polaritatea sa, cea a fazei stationare si de natura componentilor probei.

Cromatografia de repartitie pe coloana: faza stationara este un lichid ce acopera sub forma unui film un suport solid. Poate fi absorbita sau legata chimic.

Faza mobila nu trebuie sa fie miscibila cu faza stationara, deci cele doua faze trebuie sa aiba polaritati diferite. Cand faza stationara este mai polare decat cea mobila, sistemul se numeste cu faze normale. Cand e invers, este un sistem cu faze inversate.

Drept faze mobile pot fi utilizate apa, solutiile tampon de pH, alcoolii, etc. In principiu fazele stationare utilizate in cromatografia gaz – lichid pot fi utilizate si in cea lichid – lichid.

Cromatografia de schimb ionic: schimbatorii de ioni sunt materiale polimerice ce contin grupari ionogene, legate covalent de un schelet macromolecular. Sunt capabili sa schimbe ionii proprii cu ionii din solutie.

Caracterizarea schimbatorilor de ioni:

- in funtie de natura matricei: rasini sintetice schimbatoare de ioni; celuloza sau dextran schimbator de ioni; schimbatori de ioni anorganici.

- dupa tipurile de grupari functionale: cationiti; anioniti; dipolari; chelatizanti si ioi selectivi; specifici.

Capacitatea unui schimbator de ioni este definita ca fiind numarul total de ioni pe care ii poate fixa. Afinitatea este determinata de proprietatile fizice ale ionului respectiv: sarcina, raza ionului solvatat, polarizabilitate.

Detectorii folositi in cromatografia de ioni sunt in general cei electro-chimici influentati de temperatura. In cazul cromatografiei de schimb ionic este obligatorie termostatarea coloanelor si a detectorilor. Faza mobila este constituita din solutii tampon, acizi pentru separarea anionilor si baze pentru separarea cationilor.

Cromatografia de excluziune sterica: aceasta metoda, cand este folosita la separarea unor substante solubile in medii apoase, este cunoscuta si sub denumirea de cromatografie de filtrare prin gel. Prin aceasta metoda sunt separate substante cu masa moleculara mare si foarte mare. Gelurile sunt constituite dintr-o retea 3d rara, formata prin reticularea unor lanturi polimerice. Au capacitatea de a absorbi solventi nepolari sau polari. Materialul de umplutura al coloanei poate fi constituit din geluri moi, semirigide sau rigide.

Gelurile moi au un grad de reticulare redus. Pot absorbi o cantitate mare de solvent, marindu-si volumul chiar de zeci de ori.

Gelurile semirigide sunt obtinute prin polimerizare in perle. In prezenta solventului, volumul lor creste putin 1,1 – 1,8.

Gelurile rigide nu sunt cu adevarat geluri ci sticle sau silicati cu dimensiuni fixe ale porilor.

Cromatografia de excluziune sterica este utilizata in biochimie.

Cromatografia de afinitate este o metoda de separare a substantelor biologic active, bazate pe proprietatea lor deosebita de a lega selectiv si reversibil alte substante. Faza stationara este constituita dintr-un afinat legat covalent de un suport solid si se trece prin acesta o solutie a unui amestec de substante biologice active. Cele care vor reactiona cu afinatul vor fi intarziate in deplasare; pe cand cele care nu interactioneaza cu afinatul vor parasi coloana neretinute. Afinatul poate fi un inhibitor, o enzima, un antibiotic.