Inginerie Genetică

IZOLAREA, PURIFICAREA SI EVIDENTIEREA ADN GENOMIC LA BACTERII

Indiferent de protocolul aplicat, tulpinile bacteriene se cultiva in mediu de cultura lichid Luria-Bertani (sau in alt mediu adecvat pentru cultura respectiva), la 37‹C, 36h, pana la atingerea fazei stationare de crestere.

Tehnica Johnson (1991)

1- Obtinerea sedimentului celular- Din cultura bacteriana se pun 1,5ml intr-un tub Eppendorf, se centrifugheaza 10f la 8000 rpm pentru sedimentarea celulelor.

2- Distrugerea peretelui celular- Se arunca supernatantul iar celulele din sediment se resuspenda in 500 ƒÊl sol I (TEG+lizozim) 15f la 20-30‹C.

Este important ca Solutia I sa aiba un pHmin 8 pt ca lizozimul nu are activitate la pH mai mic de 8- Lizozimul este un complex enzimatic care sparge doar peretele celular, nu si membrana celulara si ca urmare liza celulara nu este completa.

Glucoza din sol I are rol de stabilizator osmotic astfel incat protoplastii sa nu se sparga imediat.

3- Liza celulara totala- Se adauga 25 ƒÊl solutie SDS20%, astfel incat conc- finala sa fie de 1%.

SDS (sodiumdodecilsulfat) este un detergent, avand ca atare capacitatea de a sparge membrana celulara- Dupa liza celulara, solutia devine foarte vascoasa si translucida.

4- Deproteinizarea enzimatica- Lizatul cellular se trateaza 1h la 37‹C cu pronaza E pana la conc- finala de 50mg/ml.

Pronaza E este - proteaza nespecifica care digera proteinele din lizatul celular.

5- Precipitarea proteinelor cu solutie salina- Se adauga 20 ƒÊl sol.KCl 2,5M (care precipita proteinele)- Precipitatul este sedimentat prin centrifugare 20min la 1200 rpm- Sedimentul contine: protein precipitate, resturi de perete celular, de membrane iar supernatantul se transfera in alt tub Eppi.

6- Deproteinizare cu solventi organici- Peste supernatant se adauga un volum de amestec cloroform:alcool izoamilic (24:1, v/v); cele 2 lichide (lizatul cellular si solventul organic) se amesteca la temperature camerei prin inversarea riguroasa a tubului- Pentru separarea rapida a celor doua lichide 7f la 1200rpm- Faza apoasa (superioara) se transfera in alt Eppi fara a se intra in interfata.

7- Precipitarea acizilor nucleici- Tubul Eppi se umple pana la semnul de 1,5 ml cu alcool isopropilic (izopropanol) aflat la temperatura camerei (20‹C) , se inverseaza tubul de cateva ori si se tine 10f la temp- camerei; precipitatul este sedimentat prin centrifugare 10-15f la 1500 rpm la 4‹C- Se arunca supernatantul prin inversarea tubului iar ultimele picaturi se aspira cu - pipeta automata (cu cat deproteinizarea este mai inalta cu atat sedimentul ADN este mai incolor si transparent)- Sedimentul se usuca 15f pe baie de apa (termostat) la 37‹C- Sedimentul ADN se resuspenda in 20-40 ƒÊl TE pH 8.0

8- Indepartarea moleculelor ARN din extract- La extractul ADN se adauga solutie stoc de RNaza A (solutia stoc are concentratia de 10mg/ml) pentru a ajunge la concentratia finala de 100-200 mg /ml- Tuburile se tin 1h pe baie de apa la 37‹C si se repet- etapele 6 si 7.

Laborator Inginerie genetic.

Facultative: sedimentul ADN se spala cu etanol 70% rece (-20‹C) sau cu amestec 70% - acetat de amoniu 7.5 M rece (-20‹C), ce se toarna incet pe peretii tubului pentru a nu disloca sedimentul; se inverseaza tubul de cateva ori; se centriguheaza 10-15 min la 1500 rpm 4‹C si se arunca etanolul.

9- Dizolvarea sedimentului ADN- : sedimentul ADN se usuca 20-30 min pe baie de apa sau (termostat) la 37‹C (tuburile Eppi se pun pe baia de apa cu capacele desfacute, iar baia de apa se lasa descoperita); sedimentul se resuspenda in 20-40 ƒÊl sol TE pH 8.0- Tuburile se tin aprox.10h la frigider 4‹C (pt dizolvarea complete a ADN), apoi se stocheaza la -20‹C.

Medii si solutii

- Mediul de cultura Luria-Bertani: bacto-triptona 1%, extract drojdie 0.5% NaCl 1% pH 7.5

- Solutia I = TEG+ lizozim =Tris 25mM, EDTA 10mM , glucoza 50mM pH 8,2 -8,7

- Lizozimul se adauga in concentratie variabila, functie de structura peretelui bacterian al tulpinii analizate (in general pentru tulpinile E- coli este suficienta conc- de 2-5 mg / ml)

- Lizozimul se adauga numai inainte de folosire si doar in volumul de TEG ce va fi utilizat in ziua respectiva (este recomandabil sa nu se stocheze ca solutie nici macar la congelator).

- SDS 20%, g/v, in a.d.

- KCl 2.5M in a.d.

- Solutie stoc de pronaza E: 20mg/ml in a.d- sterile- Se prepara 100-200ml solutie intr-un Eppi mic (de capacitate 0,5ml) steril, se portioneaza in portii de cate 10-20ml in tuburi Eppi mici sterile si se stocheaza la -20‹C- In functie de nr de tulpini luate in lucru se scot din congelator una sau mai multe portii, care odata dezghetate se folosesc imediat- Prin recongelare, enzimele isi pierd activitatea.