Biofizică LP - Medicină anul I

I. Notiuni teoretice 1. Cromatografia

Cromatografia reprezinta o tehnica de separare a componentelor unui amestec, între doua faze: una mobila si alta stationara, ca urmare a deplasarii fazei mobile de-a lungul celei stationare si a antrenarii compo-nentelor amestecului în miscare, cu viteze diferite, ocupând astfel pozitii diferite de-a lungul fazei stationare. În acest mod componentele sunt separate si apoi identificate.

În functie de natura fazelor se disting urmatoarele tipuri de cromatografie:

Faza mobila Faza stationara Denumire

lichid lichid lichid - lichid (LL)

lichid solid lichid - solid (LS)

gaz solid gaz - solid (GS)

gaz lichid gaz - lichid (GL)

Metodele de separare cromatografice se împart în:

- metode bazate pe afinitatea diferita a componentilor (repartitie de faza, adsorbtie, absorbtie, schimb ionic, afinitate);

- metode bazate pe marimea diferita a componentilor (excluziune sferica).

Din punct de vedere practic cele mai utilizate metode de cromatografie sunt: cromatografia pe coloana, cromatografia pe hdrtie, cromatografia în strat subtire, gaz cromatografia.

Cromatografia pe coloana - Coloanele cromatografice sunt confectionate din sticla. Pentru o buna rezolutie se folosesc coloane lungi dar în conditiile în care se doreste separarea unei cantitati mari de substante se folosesc coloane cu un diametru mai mare.

În interiorul coloanei se introduce faza stationara ce trebuie, într-o prima etapa, echilibrata cu solventul de lucru.

Amestecul ce urmeaza a fi separat se pipeteaza în partea superioara a tubului.

Se conecteaza rezervorul cu solvent (faza mobila) la coloana si se asteapta pâna ce are loc separarea.

Datorita deplasarii fazei mobile de-a lungul celei stationare are loc antrenarea componentelor din amestec într-o miscare descendenta, în lungul coloanei astfel încât în timp vor ocupa pozitii diferite. Fractiile sunt colectate în tuburi si apoi analizate.

Figura 4.1. Cromatografie pe coloana.

Cromatografia pe hârtie - reprezinta una din cele mai simple metode de analiza. În aceasta metoda faza fixa este reprezentata de o suprafata de hârtie speciala sau hârtie de filtru, iar faza mobila (eluentul) de un lichid ce se deplaseaza de-a lungul fazei fixe datorita fortelor de adeziune si fortelor gravitational. Se împarte în: cromatografie pe hârtie verticala (ascendenta sau descendenta) si orizontala (Pfeiffer). În figura 4.2 se poate urmari diferenta dintre aceste metode.

Figura 4.2. Cromatografie pe hârtie verticala ascendenta si descendenta

Identificarea compusilor izolati în timpul cromatografiei se face fie cu ajutorul spoturilor martor, fie calculând timpul de retinere al fiecarui component separat (Rj), definit ca raportul dintre distanta fata de linia de start pe care a migrat componentul respectiv (notata cu Xj) si distanta pe care a migrat eluentul (notata cu Y):

X, J Y

Timpul de retinere depinde de: natura fazei fixe, natura fazei mobile, natura substantei,

temperatura; se gaseste tabelat pentru diferite substraturi, eluenti si substante, de regula pentru

temperaturi de 20°C.