Microbiologie

1. Metode de evaluare a populatiilor microbiene.Clasificare.Tehnici de diluare si concentrare - metode directe, care permit evaluarea concentraţiei de celule sau a biomasei sau metode indirecte, în care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat în corelaţie cu conţinutul de biomasă (turbiditatea mediului cultivat, fluorescenta, impedanţa);- metode nonculturale, care permit evaluarea rapidă a populaţiei microbiene analizate şi metode culturale, care necesită o perioadă de incubare pentru creşterea coloniilor şi stabilirea rezultatului analizei; - metode automatizate, "on line", care permit analiza directă a probelor din fermentator, sau metode care necesită prelevarea aseptică de probe pentru analiză. Tehnici de diluare - Serii liniare, în care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie aritmetică (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) şi care sunt puţin utilizate; - Serii logarítmice (diluţii decimale), în care concentraţia de microorganisme descreşte în progresie geometrică (ex. 0.1/0.01/0.001/0.0001 etc.). Pentru realizarea diluţiilor decimale, într-un număr de eprubete sterile egal cu numărul de diluţii necesar a se efectua, se pipetează aseptic 9 cm3 de lichid de diluţie (ser fiziologic steril, apă distilată sterilă, mediu Ringer - pentru Escherichia coli). Tehnici de concentrare - utilizate în special pentru punerea în evidenţă a microorganismelor patogene; Metode de îmbogăţire, care presupun inocularea probei de analiză într-un mediu favorabil pentru multiplicarea rapidă a celulelor aflate în concentraţii reduse în proba de analizat şi, după termostatare în condiţii optime de cultivare, se verifică prezenţa sau absenţa microorganismelor analizate, fără o determinare efectivă a concentraţiei de celule; Metode de separare fizică sau fizico-chimică a celulelor prin filtrare, centrifugare, floculare, sedimentare, în care se determină concentrarea celulelor pe unitatea de volum, ceea ce asigură posibilitatea evidenţierii lor ulterioare prin tehnici directe sau culturale; Metode de separare prin interacţiuni hidrofobe-hidrofile, interacţiuni ale sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine.

2. Numararea microorganismelor prin examen microscopic direct folosind citometrul THOMA Celulele de drojdii şi sporii de mucegai se pot număra, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor. Un citometru este o lamă de sticlă groasă, prevăzută cu trei platforme separate între ele prin rigole în sticlă. Platforma centrală este denivelată faţă de celelalte două cu o înălţime de 0,1- 0,2 mm (înscrisă pe fiecare cameră). Pe platforma centrală este gravată o reţea de linii perpendiculare, care delimitează o anumită suprafaţă divizată de către linii perpendiculare în microcelule de formă pătratică (pătrăţele elementare). Diferenţierea dintre tipurile de citometre constă în mărimea variabilă a suprafeţei unui pătrăţel elementar. În cazul citometrului Thoma, suprafaţa de 1 mm2 este divizată în 400 de pătrăţele elementare cu latura de 1/20 mm. Numărul de celule prezente într-un cm de suspensie de analizat se de­termină cu formula: N = n•4 - 106 •k în care: N este numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar; k - coeficient de diluţie. În cazul bacteriilor, această metodă este greu de aplicat, atât din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor cât şi a faptului că de multe ori ele prezintă mobilitate.

3. Estimarea electronica a numarului de microorganisme.Principiul de functionare al aparatului de tip Coulter

Aparatul de tip Coulter funcţionează după următorul principiu: De o parte şi de alta a unui tub prevăzut cu un orificiu calibrat sunt dispuşi doi electrozi de platină imersaţi într-un electrolit, ale căror borne sunt conectate la tensiune continuă. Prin aspiraţia provocată la partea superioară a tubului, celulele aflate în exteriorul tubului trec pe rând prin orificiu şi deplasează o dată cu fiecare pasaj un volum de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoacă o creştere tranzitorie a rezistenţei circuitului, ceea ce generează un impuls electric a cărui amplitudine este proporţională cu volumul celulei. Impulsurile fiind de foarte scurtă durată, aparatul permite numărarea unui număr mare de celule, una câte una, într-un timp foarte scurt. Este posibilă şi o clasificare a celulelor în funcţie de de volumul lor. Această tehnică, deşi sofisticată, este considerată extrem de interesantă şi se aplică cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realizând simultan cu numărarea şi dimensionarea celulelor. Rezultatele sunt reproductibile când se utilizează suspensii diluate de celule; Sarcina electrică a celulelor poate influenţa analiza conducând la obţinerea de rezultate eronate; Această tehnică nu se poate aplica în cazul culturilor ce conţin în suspensie, alături de celulele microorganismului cultivat, şi particule solide.

4. Citometria in flux Permite numărarea şi aprecierea stării fiziologice a celulelor, când detecţia se face prin măsurarea fluorescentei emise de celulele în prealabil marcate cu un colorant (fluorocrom). După colorare celulele sunt antrenate printr-un orificiu îngust şi trec una câte una prin faţa unei surse luminoase. Fluorescenta emisă de fiecare microorganism este captată printr-un fotomultiplicator şi analizată. Rezultatele sunt traduse pe o histogramă care redă numărul de evenimente în funcţie de intensitatea fluorescentei. Această histogramă traduce deci un profil al populaţiei. Principiul de funcţionare al citometrului în flux: a, b – exemple de sisteme de detecţie

c – diagramă de repartiţie a dimensiunilor

Adesea markerii coloranţi utilizaţi pot oferi diferite tipuri de răspunsuri: - Dacă colorantul este un marker de viabilitate, din histogramă se deduce numărul de celule viabile şi starea fiziologică a populaţiei. - Dacă histograma cuprinde net două picuri este posibilă numărarea separată a microorganismelor dintr-o cultură mixtă (de exemplu, streptococi şi lactobacili). - Dacă markerul este un anticorp sau o sondă nucleică se pot număra specific anumite microorganisme dintr-o populaţie eterogenă.

5. Microscopia in fluorescenta si imunofluorescenta Tehnica de microscopie în fluorescenţă utilizează coloranţi specifici pentru diferenţierea celulelor vii de cele moarte. - prin suspensionarea celulelor de drojdie în soluţie diluată de albastru de metilen cu citrat în preparat microscopic se vor putea diferenţia celulele vii (incolore) de cele moarte (colorate în albastru). - în mod similar, pot fi diferenţiate bacteriile vii de cele moarte după colorare cu acridin oranj. Tehnica de microscopie în imunofluorescenţă permite detectarea unei categorii particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici.