Utilizarea Bacteriocinelor

Bacteriocinele sunt produsi bacterieni care au activitate antibacteriana. Acesti agenti antibacterieni sunt clasificati in doua grupuri majore in functie de masa moleculara proteica si peptidica , mica sau mare.

Bacteriocinele cu greutate moleculara mica sunt molecule de 2-2.6kDa , extrem de stabile la temperatura , pH si acizi organici. Ele contin aminoacizi rari, cum sunt lantionina si sunt denumite lantibiotice .

In contrast, bacteriocinele cu masa moleculara mare au 6.2-42kDa , sunt complexe , de dimensiuni mari si sunt putin stabile . Studiile de ultrastructura si biochimice arata ca particulele bacteriocinice sunt molecule heterogene si sunt produse de catre bacterii gram pozitive. Aceste substante au o aplicabilitate practica importanta in conservarea alimentelor sau in prevenirea si tratamentul infectiilor bacteriene .

Studierea bacteriocinelor stafilococice a cuprins producerea acestora , purificarea si caracterizarea lor. Bacteriocinele stafilococice contin de la peptide mici si simple ca epidermina produsa de Staphylococcus epidermis , pana la proteine mai complexe care contin lipide si/sau carbohidrati cum este stafilococina 414. Instabilitatea productiei de stafilococina dupa tratamentul cu agenti de genul brom-etidium si orange-acidina sugereaza ca aceste stafilococine sunt determinate plasmidial . Plasmidele purtatoare de determinanti sunt responsabile nu numai de biosinteza moleculelor de bacteriocine , ci si de reglarea lor, eliberarea lor si de imunitatea celulei gazda.

Spectrul principal al activitatii inhibitorii al bacteriocinelor este impotriva bacteriilor Gram pozitive in general si impotriva speciilor stafilococice in special.

Propietatile inhibitorii ale bacteriocinei Bac 201 din Staphylococcus aureus AB 201, par a fi similare cu acelea cu acelea ale spectrului principal al bacteriocinei Bac 1829 produsa de Staphylococcus aureus KS11829, ale Bac R1 produsa de toxina B a tulpinii Staphylococcus aureus si ale tipului 71 de fag stafilococic.

Producatoare de bacteriocine sunt si bacteriile lactice care pe langa producerea de acid lactic , secreta si aceste substante.

Bacteriocinele produse de speciile lactobacillus au activitate bacteicida si sunt utilizate in special in conservarea alimentelor.

Alt aspect important al productiei de bacteriocine de catre lactobacili este legat de potentialul de utilizare a genelor bacteriocinelor ca markeri genetici. De aceea identificarea si caracterizarea acestor bacteriocine si a genelor care le determina , sunt de mare interes.

Bacteriocine produse de genul Staphylococcus

Tulpinile izolate au fost identificate ca Staphylococcus aureus pe baza microscopiei , a morofologiei celulei si a coloniilor si pe baza caracteristicilor biochimice.

Aceasta tulpina afost conservata si propagata pe mediu de infuzie Brain Heart. Bacteriocina produsa a fost notata Bac 201.

Activitatea bacteriocinei Bac 201 a fost masurata prin metoda difuziei in strat de agar . Peste placile de agar de infuzie s-au suprapus 3 ml agar de infuzie moale care contine 0.1 ml (2x108CFU/ml) de cultura sensibila. Straturile de 5mm diametru au fost taiate din interiorul placilor de agar, plasandu-se in locul lor cate 100ml de dilutii seriate , dupa care au fost pastrate la 40C , 10-12 ore pana cand bacteriocina a difuzat in interiorul agarului. Placile au fost incubate la 370C , timp de 24ore, masurandu-se diametrul zonelor de inhibitie in mm.

Producerea de Bac 201

Pentru producerea de Bac 201 , Staphylococcus aureus AB201 a fost dezvoltat in mediu de infuzie Brain Heart la 370C , timp de 24 ore. Celulele bacteriene au fost separate prin centrifugare la 10000xg, timp de 10min, la 40C. Supernatantului fluid i s-a ajustat pH la 7 m cu 0.1 NaOH , sterilizat prin filtrare pe un filtru Millipore cu membrane de 0.22mm.

Dupa centrifugare filtratul a fost trecut printr-o membrana filtranta cu pori de 0.45mm. Activitatea antagonica a fost determinata in termen de unitati arbitrare per ml.

Precipitare cu sulfat de amoniu

Sulfatul de amoniu a fost adaugat lent la 1 litru de mediu de cultura cu agitare constanta la 40C si la o concentratiei 50%. Solutia a fost centrifugata la 40C la 10000xg, timp de 30’ . Supernatantul a ajuns in final la o concentratie de 80% sulfat de amoniu. Sistemul a fost pastrat peste noapte si precipitatul a fost recuperat prin centrifugare la 15000xg, timp de 30’ la 40C si solubilizat in 200ml solutie fosfat de sodiu 50mM , ph 7, dupa care a fost dialiazt contra aceleiasi solutii. Precipitatul a fost din nou recuperat prin centrifugare la 20000xg, timp de 15’ si resuspendat in aceiasi solutie (100ml) si a fost desemnata ca fractia 1.