Culturi de Celule Animale

Cultura celulelor. Definiție și importanță.

Prin definiţie, culturile tisulare reprezintă totalitatea tehnicilor de menţinere şi în unele situaţii de creştere şi multiplicare in vitro a unor mici fragmente tisulare extrase de la plante sau animale. Culturile tisulare sau celulare sunt necesare pentru studiul efectelor unor substanţe endogene sau exogene asupra sistemelor vii. Culturile de ţesut sunt utilizate pentru a iniţia culturi celulare.

Cultivarea celulelor animale şi umane este în prezent o tehnicǎ larg utilizatǎ de multe discipline biologice, de la cele clasice la biologia molecularǎ, în ultimii ani având largi aplicaţii practice în biotehnologii. Culturile de celule animale permit obţinerea unei game largi de produşi cu activitate biologică: imunomodulatori, anticorpi, factori de creştere, citokine, enzime şi hormoni. In prezent, mari firme cu profil biotehnologic produc din culturi de celule şi comercializează vaccinuri virale, activatorul tisular al plasminogenului (facilitează dezintegrarea cheagurilor de sânge), interferonul α (utilizat în terapia cancerului), anticorpi monoclonali şi antigene tumor-specifice (incluse în kituri diagnostic), etc. Astfel, culturile de fibroblaste/keratinocite prelevate de la pacienţi cu arsuri sunt folosite în vindecarea lor, cele din condrocite sunt larg utilizate în procesele de regenerare a cartilajului articular, etc. De asemenea, culturile celulare pot fi utilizate în studii de toxicologie, farmacotoxicologie sau cosmetologie, înainte de lansarea unor produse noi pe piaţă.

Istoric

1881 – Roux a demonstrat viabilitatea celulelor de la embrionul de găină într-o soluţie salină şi în afara unui organism viu

1907 – Harrison rezolvă controversa „doctrinei neuronale” care susţinea că extensiile neuronale se dezvoltă prin evoluţia corpului neuronal şi nu prin fuziunea celulelor care înconjură aceste extensii. El a cultivat fragmente de măduvă spinală de amfibian (ex. broască) pe cheag limfatic şi a demonstrat că extensiile neuronale se dezvoltă pornind de la corpul neuronal şi invadând suportul nutritiv.

1913 – Carrel demonstrează că unele celule pot creşte şi supravieţui pentru un timp în cultură dacă sunt alimentate corespunzător şi menţinute într-un mediu aseptic.

1948 – Earle şi colab. izolează celule din linia L şi determină formarea de clone celulare în cultură de ţesuturi.

1952 – Gey şi colab. stabilizează prima linie celulară din carcinomul cervical uman, linie cunoscută astăzi sub numele HeLa.

1961 – Hayflick şi Moorehead arată că numeroase fibroblaste mor după un număr determinat de diviziuni în cultură.

1964 – Littlefield introduce mediul HAT în vederea creşterii selective a hibrizilor de celule somatice. Odată cu punerea la punct a tehnicilor de hibridare a celulelor a fost deschisă era manipulării genetice.

1965 – Ham şi colab., a definit un mediu de cultură fără ser pentru celule de la mamifere. Au fost create primele celule hibrid umane-murine (Harris-Watkins).

1975 – Kohler şi Milstein au produs prima dată anticorpi monoclonali din linii celulare compuse din hibridoame.

1976 – Sato şi colab., arată că pentru creşterea celulelor în medii fără ser este necesară prezenţa unor factori de creştere şi hormoni.

Metode de obținere

Creșterea unei culturi se poate realiza prin intermediul mai multor tehnici, acestea fiind următoarele:

1. Metoda cheagului de plasma

În cazul acestei metode, explantul este cultivat pe suprafața unui cheag de plasmă provenit din embrion de pui sau de altă natură. Ca suport de cultură este folosită o sticlă de ceas care se poate lasă deschisă sau poate fi închisă și sigilată cu ceară de parafină. Această metodă a fost tehnica clasică pentru studierea morfogenezei în rudimente de organe embrionare. De asemenea a fost modificată pentru a studia acțiunea hormonilor, vitaminelor, a agenților cancerigeni etc. având ca material de studiu țesut epitelial provenit de la mamifer adult.

2. Metoda Raft

Această metodă constă în așezarea explantului pe un set de lentile de hârtie sau pe acetat de celofibre, de forme pătrate, care se află în suspensie pe un ser într-o sticlă de ceas. Acetatul de celofibre a fost creat să plutească pe ser prin tratarea celor 4 colțuri cu silicon. În mod similar, flotabilitatea bucăților de hârtie este consolidată prin tratarea cu silicon, ceea ce a permis adăugarea a 4 sau a mai multor explanturi pe fiecare bucată de hârtie. În combinație cu bucățile de hârtie și metoda cheag, explanturile sunt pentru prima dată plasate pe o plută adecvată, care este apoi păstrată într-un cheag de plasmă. Aceste modificări au făcut ușoare schimbări care au prevenit scufundarea explantului după lichefierea plasmei.

3. Metoda gelului de Agar

Presupune gelifierea mediului de cultură, format din soluție salină, ser, extract din embrion de pui sau un amestec de vitamine și aminoacizi, adăugând în procent de 1% agar. Această procedură evită imersia explantului în mediul de cultură. Aceste culturi sunt ținute în sticle de ceas sterile, sigilate cu ceară de parafină. Această metodă este folosită pentru a studia multe aspecte de dezvoltare a organelor normale, precum și a tumorilor.

4. Metoda Grid

Elaborată de către Trowell în anul 1954, această tehnică presupune folosirea unei bucăți de 25mm x 25mm de plasă de sârmă adecvată, sau a unei tăblițe perforate din oțel inoxidabil la care se îndoaie marginea astfel încât să se formeze 4 picioare la 4 mm înalțime. În general țesuturile osoase sunt plasate direct pe grătar iar țesuturile moi cum ar fi glande sau piele sunt introduse in prima fază pe plute, după care sunt plasate pe grătar. Acestea sunt mutate întro cameră de cultură unde sunt umplute cu mediu de cultură lichid până la nivelul grătarului. În camera de cultură este administrat un amestec de O2 și CO2 astfel încat să îndeplinească cerințele ridicate de consum de O2 necesare unui organ provenit de la un mamifer adult.