Cromatografia de Lichide de Înaltă Performanță

Cap. I Introducere

Istoria de cromatografie datează din inceputul secolul al XIX-lea. Inaintea anilor 1970, cromatografia cu coloana deschisa a fost utilizată în scop comercial în laboratoare. Termenul HPLC provine din cauza tehnicii de înaltă presiune utilizata pentru reducerea timpului care ia analizei sa se faca. După numeroase etape de dezvoltare, instrumente au devenit capabile să funcţioneze la presiuni de până la 6000 psi (400 bar). Cu o ameliorare de coloane şi

detectoare, o dezvoltare esenţială a fost realizat in privirea performanţei, astfel încât tehnica a fost

redenumita cromatografie de lichide de înaltă performanţă (HPLC), în mijlocul anilor 1970 până la sfârşitul lunii. În această perioadă, metode noi, inclusiv cromatografie de lichid de etapa inversa, au permis o separare mai bună între compuşi foarte similari. Prin anii 1980,

calculatoarele şi de automatizare au adăugat comoditate in analiza HPLC. La începutul

secolului al XXI-lea, un nou nivel de performanţă a fost realizat prin continuarea

îmbunătăţirii tehnologii de coloana care a dus la utilizarea adsorbantilor cu paricule mai mici (1,7µ m), şi dezvoltare a instrumentelor care permit aplicarea de înaltă presiune până la 1000 bar pentru a livra solventi. Rezoluţia, viteza şi sensibilitatea au crescut. Aceasta tehnologie noua se numeste cromatografie lichida ultra-performanta. (lori.academicdirect, 2012).

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) acoperă azi, în proporţie aproximativ 80%, analiza substanţelor moleculare: organice, organo-metalice şi anorganice inclusiv compuşii foarte polari sau labili termic precum şi compuşii cu masă moleculară ridicată (naturali sau sintetici). De aceea, împreună cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important în analizele chimice moderne. Deşi eficacitatea coloanelor nu o egalează încă pe cea din GC, prin faptul că se poate modifica, pe lângă faza staţionară, şi faza mobilă, cromatografia de lichide (LC) face posibile separări şi analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masă a transformat, în ultimul timp, această metodă în principalul mijloc de analiza a compuşilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijină chimia sintetică actuală şi pe care s-a dezvoltat biochimia şi biotehnologia modernă. ( traducere).

Metoda constituie o evoluţie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloană clasică, care servea în primul rând la izolarea preparativă a compuşilor naturali. Prin introducerea pompelor şi în consecinţă, lucrându-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze staţionare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze staţionare sferice, cu diametre 2-5μm), în coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, începând cu anul 1969, la configuraţia actuală (fig. 1.1). Se poate observa că din rezervoarele conţinând unul sau mai mulţi solvenţi pompa (sau pompele), alimentează coloana cu eluent (de regulă un amestec de doi sau mai mulţi solvenţi). În imediata vecinătate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. În coloana aflată într-o etuvă termostat, are loc separarea propriu-zisă. Efluentul coloanei intră într-un detector de unde componentul, dacă este separat complet, poate fi colectat şi izolat, cu ajutorul unui colector de fracţiuni. Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct în memoria unui calculator. În esenţă, un cromatograf analitic HPLC are structura din fig. 1.2 unde nu s-a mai prezentat colectorul de fracţiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemănarea cu GC singura deosebire majoră constituind-o sursa de eluent - pompa. În cele ce urmează se vor prezenta cele mai importante aspecte deoarece volumul de informaţii publicate este deosebit de amplu, un mare număr de date existând chiar pe reţeaua Internet . (lori.academicdirect, 2012).

Fig. 1.1 Prezentarea schematică a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern (lori.academicdirect, 2012)

Solvent → Pompă → Injector → Coloană → Detector → Înregistrator

Fig. 1.2. Schema bloc a unui cromatograf HPLC (C. Luca1983).

Cap II Principiul de cromatografie de lichide

Cromatografia de lichide este o metodă de separare care foloseşte o coloană umplută cu suport solid (adsorbant) şi un lichid care se deplasează prin suportul de bază. Compuşii se misca din partea de sus a coloanei care au cu etapa mobilă, prin mediul adsorbant, timp în care compuşii individuali se separă. Suportul solid, peste care etapa mobilă curge continuu, se numeşte etapa staţionară. Migraţia compuşilor la viteze diferite prin etapa staţionară este datorita diferenţei de distribuire a acestora între etapa mobilă şi etapa staţionară. Menţinerea unui compus este determinată de marimea coeficientului de partiţie dintre cele două etape; mai anume, menţinerea depinde de nivelul de interacţiune dintre compus şi etapa staţionară. Informaţiile obţinute de la un proces de cromatografie este evidenţiat de o cromatogramă, care este o înregistrarea profilului de concentraţiei ai compuşilor de probă. Cromatograma (Figura 2.1) este seria de modele (vârfuri normale Gauss) de compuşi genera ţ i de un detector care detectează schimbările în concentraţia individuală a compusilor la capătul coloanei în funcţie de timp (sau volumul etapeii mobile). Cromatograma furnizează informaţii complexe despre o probă, cum ar fi numărul de compuşi separaţi, cantitatea ( maximul înălţimii sau maxima ariei) şi identitatea (parametrii de retenţie) de compuşi individuali. (H. Nașcu, 2003).

Fig. 2.1 Varfurile cromatogrfice si atributia lor. , timpul pauză sau timpul mort al coloanei. , timpul de retenţie; vârful înălţimii, w vârful lăţimii, , varful lăţimii măsurat la jumătatea vârfului înălţimii, vârful lăţimii măsura la 4,4% a vârfului (lori.academicdirect, 2012)

Durata de timp necesară pentru un compus să treacă printr-o coloană cromatografică

se numeşte timpul de retenţie ( ). Molecule diferite iau timp diferit pentru a se muta prin coloană în etapa staţionară, dar aceeaşi cantitate de timp în etapa mobilă. Acest timp din etapa mobilă se numeşte timpul mort al coloanei sau timpul pauză al coloanei ( ).Timpul petrecut de molecule în etapa staţionară se numeşte timpul de retenţie corectat ( ), si se calculează ca diferenţă între timpul de retentie si timpul mort. tR= tRt0

Cum lichidele pot fi considerate a fi incompresibile, în cromatografie de lichid, retenţia este de obicei măsurată în unităţi de timp pentru confort. Raportul dintre timpul de retenţie corectat şi timpul mort este egal cu factorul de capacitate al compusului, care caracterizează separarea. Factorul de capacitate (k) se calculează după cum urmează: k= tR / t0 = ( tR - t0 ) / t0.

Retenţia relativă a două componente vecine este descris de: = tR( peak1)/ tR(peak2) =k(peak1) / k(peak2).

unde α este factorul de separare. Factorul de separare este de asemenea cunoscut sub numele de retenţie relativă sau selectată.

In timp ce moleculele migrează prin coloană, zona de compuşi se extinde continuu în timpul trecerii acestor compusi. Eficienţa cromatografiei este măsurată in functie de lărgirea aceste zone, care poate fi exprimată prin numărul de placa teoretic (N) sau de înălţime echivalentă cu placa teoretică (H sau HETP). Placa teoretica este proporţională cu lungimea coloanei (L): N=L/H.