Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC)

Generalitati

Cromatografia de lichide de înalta performanta (HPLC) acopera azi, în

proportie aproximativ 80%, analiza substantelor moleculare: organice, organometalice si anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labili termic precum si compusii cu masa moleculara ridicata (naturali sau sintetici). De aceea,împreuna cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important în analizele chimice moderne. Desi eficacitatea coloanelor nu o egaleaza înca pe cea din GC, prin faptul ca se poate modifica, pe lânga faza stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face posibile separari si analize uneori mposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masa a transformat, în ultimul timp, aceasta metoda în principalul mijloc de analiza a compusilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a dezvoltat biochimia si biotehnologia moderna.

In cromatografia de lichide sint folosite urmatoarele tipuri de detectoare:

- de absorbţie în ultraviolet

- şir de fotodiode (diode - Array)

- de fluorescenţă

- electrochimic

- refractometrici

Diode Array

Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu

determinarea puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice.

Principiul de utilizare.

Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriu si

xenon care emit ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in

tubul capilar (5) iar lumina dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi

cade pe dioda Array (7). Rezolutia detectorului depinde de numarul diodelor si

de numarul lungimilor de unda acoperite. Doda Array poate contin sute de diode iar semnalul de la fiecare dioda este preluat si amplificat de catre amplicator (8) ca la sfarsit sa ajunga la sistem de preluare, prelucrare si afişare a datelor (9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele pe hard disc. La sfarsitul analizei informatile oferite de fotodiode sunt afisate pe o cromatograma. Sunt oferite intensitatile substantelor din amestec (analiza cantitativa) si timpii lor de retentie (analiza calitativa).

Sensitivitatea detectorului sir de fotodiode este de 1x10-7 g/ml iar domeniu

dinamic liniar de 5x103.

Principiul de funcţionare al detectorului sir de fotodiode

1- raze in ultraviolet

2- substanţa ce vine de la coloana cromatografica

3- substanţa ce pleacă la tratament chimic

4- geam de cuarţ

5- tub capilar prin care circula substanţa de analizat

6- reţea de difracţie

7- dioda Array

8- amplificator

9- sistem de preluare,achiziţie si afişare a datelor

10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de unda)

SISTEM CROMATOGRAFIC HPLC

I. Sistemul HPLC este format din:

1. Cabinetul de solvenţi - faza mobilă

- Stocarea fazei mobile

2. Degazor ( cu vaccum)

- Condiţionarea fazei mobile ( extragerea gazelor dizolvate)

3. Pompă (izocratică, binară, cuaternară)

- Amestecarea şi deplasarea fazei mobile

4. Autosampler (sistemul de injecţie al probei lichide )

- Transferul probei de la operatorul sistemului către coloana cromatografică

5. Compartimentul coloanei

- Condiţionarea coloanei la o anumită temperatură (termostat)

- Separarea propriu – zisă (coloana)

6. Detectorul (UV – VIS) DAD

- Monitorizarea eluţiei, recunoaşterea analiţilor separaţi pe coloană

7. Staţia de prelucrare a datelor pe computer, program “LC solution”.