Determinarea unor flovonoli și antociani din semințele și pielițele strugurilor roșii prin metoda hplc-dad

Printre caracteristicile care definesc calitatea vinului, culoarea și gustul sunt factori determinanți atât în analizele senzoriale cât și în percepția hedonică. O mare parte dintre aceste proprietăți depind de un set complex de compuși, care provin din struguri, numiți polifenoli. Dintre aceștia cei mai importanți sunt antocianii și flavon-3-olii.

Antocianii sunt responsabili pentru culoarea roșie a vinului iar flavon-3-olii pentru astringența și gustul amar. Polimerizarea lor contribuie la stabilizarea culorii vinului învechit [1].

Compușii fenolici sunt în principal găsiți în pielița și semințele strugurilor roșii. Concentrația acestora depinde de soiul de struguri și este influențată de factorii de mediu și ai viticulturii [2].

În mod tradițional, data recoltării strugurilor se realizează în pragul maturității tehnologice. La maturitate, strugurii conțin o cantitate adecvată de zaharuri și acizi, deoarece, după fermentare, ambii parametri dau vinului caracteristica echilibrului alcool-aciditate. Cu toate acestea, în prezent, pentru a obține un vin roșu de calitate este necesară utilizarea strugurilor cu un nivel adecvat de compuși fenolici.

Pentru extragerea acestor compuși, în literatura de specialitate au fost propuse mai multe metode, cele mai multe dintre ele bazate pe cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) cuplată fie cu un detector cu sistem de diode (DAD) sau cu un spectrometru de masă (MS) [2].

În ciuda diferitelor studii cu privire la acest subiect, nici o metodă publicată nu abordează problema utilizării standardelor polifenolice, care sunt extrem de reactive deoarece conțin hidroalcooli și acizi.

Pe de altă parte, nici una dintre lucrările menționate mai sus nu descriu o metodă complet validată pentru a determina, într-o singură etapă cromatografică, flavon-3-olii și antocianii din boabele de struguri.

Cele mai multe dintre aceste metode folosesc malvidin-3-glucozida ca standard pentru realizarea cuantificării, dar cu nici o evaluare a erorilor pe care acest mod de lucru le presupune.

Scopul acestui studiu a fost de a optimiza și valida metoda HPLC pentru a determina și cuantifica unii dintre cei mai importanți polifenoli (4 flavon-3-oli și 5 antociani) din semințele și pielițele strugurilor roșii.

În scopul de a determina eventuala eroare care ar putea implica cuantificarea antocianilor cu ajutorul malvidin-3-glucozidei ca standard de referință, am făcut o comparație între graficele de calibrare obținute prin utilizarea diferitelor standarde antocianine.

MATERIALE ȘI METODE

Substanțe chimice și reactivi

Reactivii utilizați în această analiză sunt: acetonitrilul și etanolul de calitate grad HPLC și L (+) -acid tartric, metabisulfit de sodiu și acid clorhidric precum și acid HPLC trifluoracetic (TFA) și azida de sodiu.

Standardele utilizate sunt: (+) - catechina, (-) - epicatechina, B1 și B2 procianidina, cianidin-3-glucozida, peonidin-3-glucozida, malvidin-3-glucozida, delfinidin-3-glucozida și petunidin-3-glucozida. Toate standardele au fost de puritate > 90%.

O soluție individuală din fiecare standard (variind de la 1 la 400 mg/L-1) a fost preparat, sub N2 abur prin dizolvarea analitului în etanol și depozitat în întuneric la -18 Acidul clorhidric 0,1%, se adaugă în cazul în care se lucrează cu antociani.

Soluțiile de lucru și de calibrare au fost, de asemenea făcute sub N2 cu abur, prin diluarea soluțiilor în cantități de vin sintetic (soluție hidroalcoolică de acid tartric 5g/L-1, 12% v/v etanol și pH 3,20). Pentru a evita pierderile datorate reacțiilor dintre analiți, nu am lucrat cu amestecuri de standarde, dar am lucrat cu fiecare standard separat. Toate soluțiile trebuie manipulate sub N2 abur, utilizate proaspăt preparate și depozitate în întuneric la 4°C [3].

Pregătirea unei mostre

Printre diferitele proceduri de extracție cu solvenți găsite în literatură [4], compușii fenolici au fost extrași din părțile solide ale strugurilor (pielițe și semințe).

Procedura optimizată a fost următoarea: pielițe și semințe din 50 de boabe au fost separate manual și macerate separat la 30 timp de 48h în vin sintetic amestecat cu 40 mg/L-1 metabisulfit de sodiu și 50 mg/L-1 de azidă de sodiu. Apoi probele au fost filtrate sub vid prin hârtie de filtru (Whatman 41, 20-25 µm). Extractele au fost obținute în duplicat.

Analiza HPLC

Analizele au fost efectuate utilizând un cromatograf serie lichid de tip Hewlett-Packard 1100 cuplat la un detector cu diodă (figura1). Separarea a fost realizată utilizând o coloană Kromasil 100 C18 (250 mm x 3 mm, 5µm) termostatată la 20

Faza mobilă a fost compusă dintr-un amestec gradient de solvent A (0,2% TFA în apă Milli-Q) și B (0,2% TFA în acetonitril).

Ambii solvenți au un pH scăzut pentru a menține antocianii în cadrul formei flavilium [2]. Faza staționară a fost astfel: 0 min: 0% B; 10 min: 9% B; 25 min: 18% B; 40 min: 26% B. Debitul a fost 1 mL min-1 și volumul de injecție 10 µL. Pentru detecție și cuantificare, flavon-3-olii au fost detectați la 280 nm și antocianii la 520 nm. Toți compușii au fost eluați în 36 min.

Compușii fenolici analizați în probe au fost identificați în funcție de ordinea de eluare și comparați în funcție de timpii de retenție cu standardele pure.

Puritatea de vârf a fost verificată prin monitorizarea cromatografică a eluanților cu detector cu matrice de fotodiode. Trei spectre corespunzătoare curbei ascendente,