Tehnologii de Separare și Concentrare în Biotehnologii

Introducere

Succesele obţinute cu penicilinele au impulsionat cercetările privind obţinerea de noi produse active. În acest context s-a identificat şi caracterizat cefalosporina C, antibiotic produs de Cephalosporum acremonium, înrudit structural cu penicilina, rezistent în mediu acid, asupra germenilor gram + şi gram -. Deşi cefalosporinele de biosinteza sunt puţin active au aplicaţii terapeutice, modificarea, în anumite limite, a structurii lor naturale, la obţinerea unor antibiotice caracterizate printr-o activitate antibacteriană puternică şi un spectru antibacterian extins.

Grizofluvina a fost izolată în anul 1939 de către Oxford, Raistrik şi Simonart din cultura de Penicillium grizeofulvum. Prima sinteză totală a grizeofulvinei a fost realizată în 1960 din 2-clor-3,5-dimetoxifenol şi 2-metoxi-4-acetoxi-6-metil-benzoilclorura. Elementul structural principal al grizeofulvinei este nucleul aromatic, iar denumirea produsului precipitat este grizeofulvin.

I Structura chimică a grizeofulvinei

Grizeofluvina, Fulvina, Grifulvin, Grisactin, 7-clor-4, 6-dimetoxicumaran-3-on-2metoxi-6-metilciclohexen-4-ona e un antibiotic de biosinteză cu acţiune antifungică sistematică, fiind utilizată în tratarea micozelor părului, pielii, unghiilor. Se prezintă sub formă de pulbere albă, cristalină, cu p.t. 220.5, greu solubile în apă, acetone, acetate de etil, solubile in DMF, CH2Cl2, acid acetic, dicloretan.

Grizeofulvina, produs rezultat din metabolismul fungilor Penicillium grizeofulvum, P.notatum, P.urticae, P. patulum conţine în structura sa ciclul grizan pe care sunt grefate grupări metilice, metoxilice, cetonice, halogen.

Molecula grizeofulvinei conţine un ciclu benzenic (A), un heterociclu de 5 termeni (B) şi un ciclu hidroaromatic (C). Ciclurile A şi B sunt condensate, formand un sistem cumaronic. Atomul de carbon 2, comun ciclurilor B şi C, caracterizează strucutura spiranică. Acest carbon, ca şi cel din poziţia 6|, e asimetric şi conferă grizeofulvinei proprietăti optic active.

Grizeofulvina naturală conţine gruparea 3-carbonil şi gruparea 6|-metil în poziţia cis (d-grizeofulvina), iar antipodal optic cu aceste grupări în poziţia trans, e biologic inactive.

Grizeofulvina conţine 3 grupe metoxi, un atom de clor, o legătură dublă în ciclul C şi o grupă carbonil – 41 reactivă. Structura chimică a grizeofulvinei a fost stabilită prin reacţii de degradare şi prin sinteză totală.

Hidroliza grizeofulvinei cu hidroxizi diluaţi conduce la acidul norgrizeofulvinic (V), iar cu hidroxizi conduce la acidul decarboxigrizeofulvinic (VI) si izodecarboxigrizeofulvinic. Prin tratarea grizeofulvinei cu NaOH 3N la 500C în mediu de dimetilformamidă se deschide ciclul B (VIII), iar prin topire cu KOH se obtine orcinol (IX). La hidroliza acidă a grizeofulvinei se formeaza acidul grizeofulvinic (X) şi izogrizeofulvinic (XI).

Prin oxidare cu oxid de potasiu a grizeofulvinei se formează acidul 3-clor-2-hidroxi-4,6-dimetoxibenzoic (XII) şi acidul 7-clor-2-hidroxi-4,6-dimetoxicumaranon-2-butiric (XIII), iar prin reducere cu Zn şi acid acetic sau paladiu în alcool butilic terţiar se formează un amestec de benzofenonă.(XIV).

Datorită grupării carbonil active din poziţia 41- cea din poziţia 3 din motive sterice nu este grizeofulvina reactionează cu reactivii cetonelor: cu dinitrofenilhidrazina dă un compus monodinitrofenilhidrazinic (XV), iar cu hidroxilamina formează monooxime. (XVI).

Prin clorurarea grizeofulvinei cu un mol de clor, în mediu de clorură de metilen, se formează 5-clor-grizeofulvina, iar cu doi moli de clor se formează 5,31-diclorgrizeofulvina.

II Sinteza grizeofulvinei

Pentru deplina confirmare a structurii acestui antibiotic s-au efectuat lucrări de sinteză, dar randamentele obţinute au fost foarte mici.

Prima sinteză totală a grizeofulvinei a fost realizată în 1960 din 2-clor-3,5-dimetoxifenol şi 2-metoxi-4-acetoxi-6-metil-benzoilclorura.

Din reacţie rezultă grizeofulvina racemică din care se separă izomerul cu cinconina. Pentru asta se hidrolizează, în mediu acid, grizeofulvina racemică la acid grizeofulvinic şi se separă prin tratare cu cinconina. Prin tratarea complexului format cu HCl se eliberează acidul grizeofulvinic(+) care cu diazometan (agent de metilare) trece într-un amestec de grizeofulvina (+) si izogrizeofulvina (+); separarea acestor doi izomeri se face cromatografic.

O altă metodă de sinteza a grizofulvinei utilizeaza ca derivaţii de cumarona. Dupa aceasta metoda 7-clor-4,6- dimetoxicumaron-3-ona reactionează cu metoxietinilpropenil cetona în prezenta de t-butoxidul de potasiu, când se obtine direct, prin dubla adiţie Michael, grizeofulvina racemică, care se separă cu cinconina.