Crioconservarea Spermei de Câine

PARTEA I. STUDIUL BIBLIOGRAFIC

CAP.1. CRIOCONSERVAREA SPERMEI DE CÂINE

1.1. Generalităţi

Crioconservarea spermei canine a devenit o practică larg utilizată în medicina veterinară. În timpul crioconservării, spermatozoizii suferă o răcire drastică, de la temperatura corpului la temperatura azotului lichid (-197º C). Înaintea utilizării spermei congelate, aceasta suferă un proces invers, de readucere la temperatura de 37°C. Practic, sperma congelată poate fi menţinută nedeterminat, posibil sute de ani, aceasta rezistă la temperatura scazută la care este depozitată dar spermatozoizii întâmpină probleme la schimbările de temperatură, la care sunt supuşi de-a lungul proceselor de congelare şi decongelare. Modificările la nivelul celulei spermatice se petrec pe parcursul diferitelor etape de prelucrare, principala acţiune detrimentală fiind şocul termic. Şocul termic se manifestă prin scăderea motilităţii şi modificarea formei de mişcare (mişcări circulare, retrograde, vibratorii), diminuarea energiei, pierderea ionilor şi a moleculelor din membrana plasmatică, moartea celulelor. Cel mai mare stres al spermatozoizilor în timpul congelării, decongelării este indus de modificările osmotice, dezhidratare şi formarea cristalelor, ce au loc la o temperatură de -15 la -60 º C. Spermatozoizii pot fi afectaţi la încălzire prea rapidă ori prea lentă. În timpul îngheţării prea lente apa părăseşte celula şi îngheaţă în afara ei, spermatozoizii fiind afectaţi de expunerea la o concetraţie prea mare de soluţie (asa numita„soluţie de efect”) şi de ingustarea celulară în exces (44). Când congelarea e prea rapidă, apa îngheaţă în interiorul celulei, procesul fiind o potenţială sursă de distrugere. Micile cristale de gheaţă intracelulare nu sunt obligatoriu dăunătoare pentru spermatozoizi. Oricum, dacă reîncalzirea nu este efectuată suficient de repede, cristalele cresc în dimensiune şi pot provoca distrugeri celulare. O prea rapidă decongelare la o congelare prea lentă poate crea un stres osmotic rezultând umflarea spermatozoizilor.

Numarul minim de spermatozoizi pentru a obţine o rată maximă de gestaţie în urma însămânţării artificiale nu a fost stabilit. Pentru a obţine o doza de inseminare cu cel puţin 100 x 106 spermatozoizi /ml viabili sunt necesare în mod normal între una si cinci paiete de 0,5 ml, depinzând de numarul de spermatozoizi / paietă şi de rata de supravieţuire post decongelare.

1.2. Etapele crioconservării spermei

1.2.1. Centrifugarea

Centrifugarea spermei este o metodă uzuală, utilizată în tehnicile de prelucrare a spermei, pentru separarea spermatozoizilor de plasma seminală (11). Fluidul prostatic nu este optim pentru conservarea spermei de câine la 4º C şi exercită efecte negative asupra spermatozoizilor în timpul procesului de congelare (63). Studii legate de procesarea spermei umane au relevat faptul că centrifugarea este o etapă cu efecte negative asupra spermatozoizilor, inducând efecte subletale (48). Spermatozoizii umani (1) şi ai unor mamifere precum şobolanul şi şoarecele (10) sunt foarte sensibili la forţe mecanice şi centrifugale, reclamând o atenţie deosebită în timpul manipulării pentru a limita deteriorarea lor. Spermatozoizii altor specii precum ecvinele şi bovinele (39) sunt ceva mai puţin sensibili la centrifugare. Aceste constatări indică importanţa deosebită a specificităţii de specie a nivelului efectelor detrimentale produse de centrifugare asupra spermatozoizilor (11)

Protocoalele curente de crioconservare a spermei de vier recomandă centrifugarea spermei cu scopul separării spermatozoizilor de plasma seminală. Experimentele realizate pe vier au demonstrat că prin centrifugare se scoate fracţiunea plasmatică. Parametrii de centrifugare şi rezultatul obţinut au fost: la 800 X g – 10 min - 19% pierderi o dată cu supernatantul; la 800 sau 400 X g – 3 min - pierderi mai mici; 2400 sau 1600 X g – 5 min - mărirea depozitului de spermatozoizi; 2400 X g – 3 min - depozit aproape neschimbat. Analizând rezultatele obţinute se poate aprecia că la o centrifugare relativ mare (g force) 2400 X G şi la un timp scurt (3 min.) se obţine un depozit relativ mare după înlăturarea supernatantului, fără să afecteze funcţional sperma. În alte cazuri, la centrifugarea spermei de şoarece, şobolan sau om s-au observat modificări ale viabilităţii acesteia (86)

Unul dintre efectele detrimentale observate consecutiv centrifugării spermei este apariţia speciilor reactive ale oxigenului (ROS) - marker în centrifugarea spermei mamiferelor.

Speciile reactive ale oxigenului (ROS) sunt molecule active produse în timpul reducerii oxigenului care sunt implicate în efectele negative asupra viabilităţii şi funcţiei spermei când ajung la concentraţii mari. Peroxidarea fosfolipidelor membranare duce la scăderea motilităţii, viabilităţii şi a elementelor citologice, schimbări metabolice şi alterări structurale ale spermatozoizilor. Cea mai importantă enzimă antioxidantă implicată în detoxifierea spermatozoizilor mamiferelor este superoxid dismutaza (SOD), studiindu-se efectul protector al activităţii acestei enzime împotriva stresului oxidativ ce apare odată cu prezenţa ROS în sperma canină. (12)

Centrifugarea determină o creştere a speciilor reactive ale oxigenului (ROS) în spermă. SILVA (73) a demonstrat că nivele ridicate ale ROS sunt asociate cu alterări membranare prin peroxidare lipidică. Peroxizii lipidici acţionează în calitate de substanţe lezante prin modificarea proprietăţilor membranei celulare şi a membranei mitocondriilor şi lizozomilor (creşterea fluidităţii, fragilităţii şi permeabilităţii), ceea ce duce la dispariţia gradienţilor osmotici, chimici şi electrici. În acest fel scade sau este anulată excitabilitatea celulară, perturbându-se profund procesele metabolice, cu apariţia leziunilor morfologice.

Creşterea valorii ROS a fost semnificativ mai mică în cazul centrifugării spermei la 2 minute faţă de centrifugarea la 10 minute. Deci, timpul de centrifugare e mult mai important decât forţa de centrifugare în formarea speciilor reactive ale oxigenului în spermă. Astfel, se recomandă centrifugarea spermei pe o perioadă scurtă de timp tocmai pentru a îmbunătăţi tehnicile de prelucrare a acesteia.

Producerea speciilor reactive ale oxigenului (ROS) poate fi determinată şi de prezenţa celulelor sanguine ale liniei albe(70)

Deşi semnificaţia leucospermiei asupra spermei rămâne controversată, există date care confirmă efectul negativ al celulelor albe ale sângelui asupra funcţiei spermei, acestea reprezentând un cofactor al infertilităţii masculilor. Totuşi, mecanismele prin care leucocitele pot altera funcţional sperma rămân necunoscute. Investigaţii recente sugerează că speciile reactive ale oxigenului (ROS) generate de granulocitele polimorfonucleare (PMN), pot deasemenea afecta funcţional sperma. ROS se pot măsura prin chemoluminescenţă, iar concentraţia leucocitelor din spermă se poate măsura prin tehnica de colorare a mieloperoxidazei ca de exempu testul Endtz (70)