Tehnologia ADN Microrray - DNA Cips

Abordarile genomice din ultimul deceniu au determinat o transformare fundamentala a conceptului de cercetare in biologie si medicina. In schimbul evaluarii unui singur biomarker studiile de genomica functionala sunt capabile sa furnizeze date despre intregul transcriptom al celulelor studiate.

Genomica functionala, utilizand tehnica microarray, poate furniza informatii asupra expresiei simultane a mii de gene sau chiar a intregului genom uman. Profilul de expresie genica al unui tip de celule ii determina functionalitatea, fenotipul si raspunsul la terapie.

Tehnologia microarray a permis identificarea unor seturi de gene supra si sub exprimate in diferite patologii: cancerul de san, cancerul de prostata, cancerul pulmonar, precum si in dereglarea anumitor procese fiziologice: inducerea apoptozei, si raspuns la terapie. Analizele integrate ale mai multor studii, permise de numarul in crestere al publicatiilor in domeniu, au evidentiat generalitati si particularitati ale expresiei genice in anumite patologii.

Utilizarea microarray-urilor, in cercetarea biomedicala, nu se limiteaza doar la deteminarea profilului de expresie genica, fiind deasemenea folosite pentru detectia SNP-urilor (single nucleotide polymorphism), aberatiilor de metilare, detectia splicing-ului alternativ, detectia de patogeni, amplificare genica, detectia genelor de fuziune.

In ultimul deceniu, array-urile de mare densitate, standardizarea protocoalelor de hibridizare, precizia tehnologiilor de scanare si dezvoltarea unor metode computationale robuste, au impus tehnologia microarray ca un instrument genomic puternic si usor de folosit. Tehnologiile microarray au devenit metodele preferate pentru evaluarile la scara larga a expresiei genice datorita accesibilitatii, eficientei, costului si a protocoalelor standardizate.

Microarray-ul este o matrice solida miniaturizata pe care sunt depozitate intr-o ordine bine stabilita mii de fragmente de acizi nucleici. Principiul de baza al tehnicii microarray este similar principiului Southern blot-(hibridare ADN-ADN), respectiv Northern blot (hibridare ARN-ADN) si se bazeaza pe complementaritatea secventelor genice de a se recunoaste intre ele si de a detecta prezenta sau absenta ADN-ului sau al ARN-ului de interes, folosind o serie de detectori radiologici, fluorogenici sau chemiluminiscenti. cDNA-ul sau cARN-ul, sintetizat prin reactia de revers transcriptie de pe mARN-ul extras din proba de interes, este marcat fluorescent si hibridizat pe suprafata arrayului. Cuantificarea nivelelor de expresie se bazeaza pe faptul ca intensitatea semnalului fluorescent al fiecarui spot este direct proportionala cu cantitatea de mARN prezenta in proba analizata, care a hibridizat in spotul respectiv. Tehnica microarray compara nivelele de expresie a unei gene in doua conditii diferite (ex. cancer vs normal).

fig. 1 Hibridizarea fragmentelor pe suprafata arrayului

La sfarsitul anilor ’90 au fost realizate sisteme robotizate sofisticate capabile sa pozitioneze fragmente de ADN pe suporturi de sticla la o densitate imposibil de realizat prin procese manuale. Pat Brown si colab. au fost primii care au dezvoltat tehnologia microarray de mare densitate. Din acel moment a inceput o adevarata dezvoltare a acestor tehnologii atat la nivel academic cat si comercial.

Platformele actuale de microarray difera intre ele prin tipul de sonda utilizata (suportul de hibridare de pe suprafata array), design (membrana de nylon, lama de sticla, chip array), tehnologia de fabricare a sistemelor de tip array (printare sau depunere), protocoalele de marcare si hibridare (monocolore sau bicolore).

In domeniul evaluarii expresiei genice sunt utilizate mai multe platforme microarray care se bazeaza pe utilizarea suporturilor array ce contin cDNA sau oligonucleotide.

Un sistem cDNA microarray cuprinde o colectie de mii de sonde care, in general, corespund produsiilor PCR apartinand unor banci de cDNA. Primul pas in producerea cDNA microarray-urilor este selectarea din bazele de date publice (UniGene, RefSeq, GenBank) a secventelor ce urmeaza a fi pozitionate pe array, urmata de amplificarea prin PCR a genelor de interes, folosind primeri specifici, si purificarea produsilor PCR. Fragmentele astfel obtinute sunt depozitate, in pozitii bine determinate, pe suprafata array-ului, prin depunere robotizata.

Dimensiunile zonelor de depozitare (spoturilor) au diametre de aproximativ 100-200 m. Spoturile sunt separate de zone libere cu distante similare, ajungandu-se la densitati de 20.000 spoturi/cm2. Arrayurile pot fi din nylon, nitroceluloza sau sticla.

Aceasta tehnologie permite producerea la un cost relativ redus a arrayurilor personalizate pentru fiecare studiu, cu un numar moderat de spoturi. Un avantaj al sistemelor cDNA microarray este posibilitatea producerii arrayurilor cu structuri clonate care nu au fost inca secventiate, ceea ce poate facilita descoperirea de noi gene. Dezavantajul sistemului microarray cDNA consta in dificultatea mentinerii si utilizarii unor colectii voluminoase de clone de cDNA.