Identificarea Proteinelor prin Analize Spectrometrice de Masă de Peptide

Accentul acestui capitol este pus pe izolarea şi analiza de subseturi de proteine. Aceste metodologii pot fi aplicate pentru a adresa întrebări fundamentale în multe domenii de cercetare biologică. Protocoalele sunt prevăzute pentru tehnici comune care includ izolarea proteinelor din celulele mamifere şi identificarea ulterioară de peptide derivate din proteinele endogene prin acţiunea de proteaze.

1. Introducere

Domeniul de cercetare proteică este acum foarte mare şi diversificat şi, ca atare, nu este posibil ca să acopere toate tehnicile comune. Acest articol se va concentra pe izolarea şi analiza de subseturi de proteine. Aceste subproteice sunt destinate pentru a selecta pentru proteinele care sunt legate în mod biologic semnificativ- de exemplu, proteine care interacţionează una cu alta sau cu alte proteine care conţin o fracţiune carbohidrata sau un grup fosfat.

Aceste metodologii sunt de obicei utilizate pentru a aborda întrebările care sunt puse în multe domenii de cercetare biologică. Prin urmare, acest capitol nu va lua în considerare unele tehnici foarte interesante, cum ar fi proteica “pusca” sau tehnologia ICAT, care se adreseaza analizei globale sau foarte complexe de proteine, utilizând protocoale multidimensionale cromatografice.

O metodă comună care nu va fi luată în considerare aici este electroforeză bi-dimensională de proteine înainte de identificarea proteinelor. Acest subiect a fost analizat pe larg în altă parte. În plus, acest capitol, nu va încerca să revizuiască diferitele instrumente disponibile pentru a analiza probe, folosind spectrometria de masă. Unele instrumente sunt capabile de a analiza proteine direct (de exemplu, analiza MS folosind o platformă MALDI) şi altele analiza peptidelor (LC MS / MS), derivate din proteine endogene prin acţiunea de proteaze. Proteaza angajat este foarte des întâlnită, dar nu exclusiv, tripsina şi analiza de peptide permite proteinei- mamă să fie identificată.

Spectrometria de masă este un instrument analitic folosit pentru măsurarea masei moleculare a unei substanţe. Această metodă este utilă pentru elucidarea structurilor de compuşi organici si secvenţelor de peptide si oligonucleotide.

Spectrometria de masă este o metodă fizică utilizată, în special, pentru analiza substanţelor organice ce constă, în esenţă, în ionizarea substanţei investigate, urmată de separarea ionilor obţinuţi în funcţie de raportul dintre masă şi sarcină.

Spectrul de masă reprezintă înregistrarea maselor şi a abundenţelor relative ale ionilor obţinuţi. Spectrul de masă este o caracteristică a fiecărui compus, iar identificarea ionilor rezultaţi în cursul fragmentării permite, de multe ori, stabilirea completă a formulei structurale.

Schema de principiu a unui spectrometru de masă:

1. rezervor de vapori; 2. frită; 3. catod; 4. anod;

5. zonă de accelerare; 6. fante de focalizare;

7. tubul analizorului; 8. magnet; 9. detector;

10. amplificator; 11. înregistrator.

Schema bloc a unui spectrometru de masă

Domeniu de utilizare

Spectrometria de masă este utilizată in industrie şi in mediul academic cât şi în cercetare. Cele mai importante domenii de aplicaţie ale spectometriei de masă sunt:

- Biotehnologia: analiza de proteine, peptide si oligonucleotide;

- Domeniul farmaceutic: descoperirea de medicamente, farmacocinetică;

- Clinic: analiza hemoglobinei;

- În mediu: calitatea apei, contaminarea alimentelor;

- Geologie: ulei de compoziţie.