Tehnologia ADN-ului recombinant - endonucleaza de restricție

Tehnologia ADN-ului recombinant, care este cunoscuta si sub numele de clonarea genelor sau clonare moleculara, reprezinta termenul generic care cuprinde un numar de protocoale experimentale care toate conduc catre transferul de informatie genetica (acidul dezoxiribonucleic - ADN) de la un organism la altul. Nu exista un unic set de metode care sunt utilizate pentru a ajunge la rezultatele mai sus amintite; cu toate acestea, experimentul ADN-ului recombinant urmeaza adesea formatul urmator (fig. 1).

• ADN-ul (ADN-ul clonat, ADN-ul inserat, ADN-ul tinta, ADN-ul strain) extras de la un organism donator, este scindat din punct de vedere enzimatic (taiat, incorporat), reunit si suportand o ligatura cu o alta entitate ADN (un vector de clonare) in vederea formarii unei molecule noi de ADN recombinat (vector inserat de clonare ADN construit, ADN construit).

• Acest ADN construit este transferat in interior si pastrat in cadrul unei celule gazda. Introducerea ADN-ului in interiorul unei celule bacteriaene gazda poarta denumirea de transformare.

• Aceste celule gazda care preiau ADN-ul construit (celulele transformate) sunt identificate si selectate (separate, izolate) de acelea care nu iau parte la acest proces (nu procedeaza in acelasi mod).

• Daca este necesar, un ADN construit poate fi preparat in asa fel incat sa asigure ca producerea de proteina care se gaseste in codul secventei de ADN clonat, sa fie realizata de catre celula gazda.

Tehnologia ADN-ului recombinant s-a dezvoltat ca urmare a cercetarilor facute in cadrul biologiei moleculare, studiului enzimologiei acidului nucleic, si a geneticii moleculare atat a virusilor bacterieni, cat si a elementelor bacteriene extracromozomiale ale ADN (plasmidele). Cu toate acestea, tehnologia ADN-ului recombinant n-ar fi putut exista fara validitatea enzimelor (enzimele de restrictie, endonucleaze de restrictie) care identifica secventele de ADN specific dublu catenar si care desparte ADN-ul, atat in catene cat si in acele secvente.

Endonucleaze de restrictie

In ceea ce priveste clonarea moleculara, atat sursa ADN care contine secventa tinta, cat si vectorul de clonare trebuie sa fie sectionate fara exceptie in fragmente fine reproductibile. Izolarea cromozomiala ADN este realizata fie prin patrunderea unui ac de calibru foarte mic sau prin procedeul sonic. Oricare din cele doua metode trebuie sa aiba ca urmare producerea de fragmente de ADN sub forma de siruri, care pot varia in lungime de la 0,3 la 5 kilobase (kb). Din nefericire, aceste proceduri uzuale pot induce ruperi pe alocuri, asa incat ori de cate ori o mostra de ADN este tratata, pot fi generate si alte seturi de fragmente. Numai in cazul enzimelor bacteriene care sectioneaza in interior moleculele de ADN in secvente catenare perechi, s-a evidentiat ca clonarea moleculara este viabila. Aceste enzime poarta numele de endonucleaze de restrictie de tip II.

Unul din primele tipuri de endonucleaze de restrictie evidentiate au fost cele de la bacteria Escherichia Coli si a primit denumirea de EcoRI. Aceasta enzima se leaga de o zona ADN cu o secventa specifica palindromica (cele doua siruri sunt identice in aceasta zona atunci cand indica aceeasi polaritate, ex. de la 5' la 3') din cele 6 perechi (bp), sectionandu-se intre reziduurile de guanina si adenina ale ambelor siruri (fig. 2.). Bifurcatia are loc intre legatura nucleotidica dintre oxigen si carbon 3' a particulei de zahar a unei nucleotide si grupul de fosfati, care se afla atasat de carbon 5' din particula de zahar a nucleotidei adiacente. Aceasta bifurcatie de o simetrie surprinzatoare a ADN-ului EcoRI produce doua siruri singulare, complementare la capete, fiecarea avand cate patru nucleotide ca si extensii. In acest caz, fiecare extensie a sirului se termina intr-un grup 5' fosfat, iar grupul 3'-hidroxil de la sirul opus este absent.

In completare la EcoRI, sute de alte endonucleaze de restrictie de tip II au fost izolate de la diverse bacterii. Protocolul de denumire pentru aceste enzime este acelasi cu cel pentru EcoRi; genul este evidentiat cu litere mari, iar primele doua litere ale numelui speciei sunt reprezentate cu litere mici. Desemnarea sirului este adesea scapata din vedere in ceea ce priveste denumirea, fiind utilizate cifrele romane pentru a desemna ordinea caracterizarii diferitelor endonucleaze de restrictie ale aceluiasi organism. De exemplu, HpaI si HpaII reprezinta primul si al doilea tip de endonucleaze de restrictie care au fost izolate de la Haemophilus parainfluenzae.

Cele mai multe dintre secventele palindromice fac parte din tipul II de endonucleaze de restrictie taiate si legate de molecula de ADN, asa numitele situsuri de recunoastere. Unele dintre endonucleazele de restrictie ale ADN-ului incorporat (scindat), lasa extensiile 5' fosfat, altele lasa extensiile 3' hidroxil si altele taie in structura scheletului ambele catene din cadrul situsului de recunoastere pentru a produce molecule de ADN (fig. 3.). Lungimea situsurilor de recunoastere a diferitelor enzime poate fi patru, cinci, sase, opt sau mai multe perechi de nucleotide. (Tabelul I). Datorita frecventei cu care situsurile de recunoastere apar in ADN, endonucleazele de restrictie care scindeaza in cadrul situsului de patru (divizat in patru), de sase (divizat in sase) perechi de nucleotide sunt utilizate in cele mai multe dintre protocoalele clonarii moleculare.