Transformarea la Saccharomyces Cerevisiae

Deoarece S. cerevisiae are un genom mic, timpul relativ de dublare scurt si poate fi analizata genetic, multe dintre progresele facute in biologia moleculara au folosit acest precedent ca un mijloc de cercetare.

Acest organism are importanta industriala de asemenea pentru producerea berii, painii, vinului si peptidelor si proteinelor recombinate.

Folosirea lui S.cerevisiae ca organism gazda pentru a exprima fara nici un defect structura ADN-ului, introdusa sub forma deplasmid, a fost o parte importanta a avantajelor curente care au avut loc in tehnologia recombinarii ADN-ului(Botstein and Fink 1988)

Tehnicile de transformare sunt asemanatoare cu cele de la Escherichia coli,dar cu diferente semnificative in cea ce priveste complexitatea peretelui celulei pentru prima dintre ele.

Transformarea primei are loc in una sau doua metode: fie prin formarea sferoplastilor, incluzand inlaturarea peretelui celulei(Hinnen,1978), sau printr-un tratament si mai rapida celulelor cu cationi alcalini(Ito,1983).

Formarea sferoplastilor intamplina diferite dificultati asociate relativa stabilitate osmotica a celulelor si procedurile incomode.

Tehnicile de electropotation au fost folosite pentru transformarea drojdiilor de asemenea (Becker si Guarente,1991) si ofera avantajul de a folosi mici cantitati de ADN pentru a obtine transformarea, dar adesea pentru a expune tensiunea specifica trebuiesc folosite aparate costisitoare.

Inbunatatirile metodei cu cationi alcalini (Gietz,1992) a facut din aceasta metoda simpla si eficienta metoda aleasa pentru cercetarea in teren.

Prin expunerea celulelor de drojdii,care au fost culese pe durata fazei logaritmice de crestere, in conditiile cationilor alcalini(acetat de litium,clorura de rubidiu), socuri de temperatura si tratament su poly-alcool, schimabrile pot si incluse in anvelopa cea ce faciliteaza participarea plasmidului.

Aditia ADN-ului mesagerde altfel promoveaza participarea ADN-ului vector.ADN-ul mesager permite formarea de complexe de molecule mici de ADN cu molecule mai mari de ADN mesager.

Complexul mai mare rezultat atinge suprafata celulei mai usor pentru participarea subsecventei.

Ca si la E.coli, numerosi factori influenteaza eficienta transformarii. Aceasta include marimea plasmidului, configuratia si calitatea ADN-ului, tulpina gazda si procedurile selectiei.

Totusi transformarea la E. Coli este realizabila cu o eficienta cuprinsa intrea 104 si 10 5 unitati pe microgram de ADN pentru unele plasmide si tulpini.

Plasmidul pRY121 folosit in acest scop serveste ca un mijloc instructional..

Este „vector nava„ ce codifica o proteina expresibila, βgalactoza, care faciliteaza detectarea.

In plus expresia acestei proteine este cuplata la un element de control genetic, initiatorul GAL.O descriere a plasmidului e data in Exercitiul 8.