Analize Calitative și Cantitative ale Carotenoidelor

Introducere, definiții și caracteristici

Carotenoidele sunt pigmenți neazotați, universal răspandiți atât în țesuturi vegetale,cât și în cele animale. Acestea se găsesc într-un număr mare de fructe și legume, unele produse de origine animală (ouă, unt, lapte) și alimente marine (somon, creveți, moluște, păstrăv, etc). Carotenoidele (tetraterpene) sunt clasificate astfel: carotene sau hidrocarburi carotenoide, compuși numai din carbon și hidrogen (licopen și β-caroten) și xantofile sau carotenoide oxigenate și pot conține grupări funcționale ca: epoxi, carbonil, hidroxil, metoxi sau acid carboxilic [1].

β-caroten [A]

Sunt substanțe insolubile în apă, dar solubile în solvenți organici. Toți pigmenții carotenoidici prezintă spectre de absorbție specifice în vizibil sau ultraviolet, care servesc la identificarea și dozarea lor. Carotenoidele sunt sensibile la căldură, lumină, oxigen și acizi. Prin expunerea la lumină, în mod deosebit la lumina solară directă sau la lumina ultravioletă, se realizează fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate duce astfel la fotodistrugerea lor [2].

În prezență de oxigen (aer) sau de peroxizi, multe carotenoide pot fi oxidate. Ele sunt deosebit de sensibile la oxigen în stare absorbită, cum sunt în fază absorbită pe cromatograme, pe coloană și pe strat subțire. De aceea se recomandă să se lucreze în atmosferă inertă, în general azot sau vacuum. Oxidarea în timpul extracției și saponificării poate fi minimă prin utilizarea unei atmosfere de azot. Sursă de peroxizi ce pot duce la formarea de epoxicarotenoide o constituie eterul etilic. De aceea acest solvent trebuie să fie proaspăt distilat. Depozitarea și păstrarea pigmenților carotenoidici se face la întuneric, sub atmosferă de azot sau în vacuum la temperatură în jur de -20ºC. Cel mai bine se păstrează în stare cristalină. Păstrarea sub formă de soluție se face mai bine în eter de petrol, hexan sau benzen [2].

Metode de analiză

Creșterea interesului pentru identificarea directă a carotenoidelor în matricea biologică (fără o pregătire prealabilă a probei) a dus la dezvoltarea unor altor tehnici de determinare în acest scop. De exemplu, spectroscopia de reflexie infraroșu apropiat (NIRS), spectroscopia Raman, rezonanță magnetică nucleară (RMN), spectroscopie și spectrometrie de masă [3]. Printre metodele cromatografice de înaltă performanță disponibile, gazcromatografia (GC) este nepotrivită pentru analiza de carotenoide din cauza instabilității inerente și volatilitatea scăzută a acestor molecule.

Analiza cromatografiei de lichide de înaltă performanță (HPLC)

Bazată pe proprietățile chimice și fizice ale carotenoidelor, cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC), utilizând detectoare diferite de absorbție a devenit cea mai folosită metodă de analiză pentru determinarea proprietăților carotenoide, atât calitative cât și cantitative.

Au fost utilizate pentru analiza carotenoidelor sisteme în fază inversă și normală în modurile de eluare izocratic sau pantă. Cu toate acestea, cele mai multe separări ai acestor compuși raportate în literatura de specialitate implică faza inversă HPLC utilizând coloane C18 și C30. Performanța coloanelor depinde de mai mulți parametri (lungimea fazei alchil, activitatea silanol, densitatea aderentă, diametrul porilor cu substrat, etc). Diverse amestecuri de solvenți au fost folosiți cu aceste faze inversate, inclusiv apa, metanol, acetonitril, 2-propanol, acetonă, acetat de etil, tetrahidrofuran, t-butil metil eter (TBME), diclormetan și cloroform [1].

În general, fazele polimerice C30 oferă separări mai bune de izomeri geometrici carotenoizi decât C18. Fazele staționare C18 produc separări relativ bune ale acestor izomeri, de exemplu, fazele polimerice C18 au oferit selectivitate acceptabilă pentru separarea izomerilor geometrici β-caroten, luteina și zeaxantina. Tabelul 1 prezintă sistemul cromatografic utilizat pentru separarea cis-și trans-izomerilor ce utilizează o serie de faze staționare.