Determinarea Proteinelor Prin Metode Optice

DETERMINAREA PROTEINELOR PRIN METODE OPTICE

Proteinele sunt substanțe organice macromoleculare formate din lanțuri simple sau complexe de aminoacizi; ele sunt prezente în celulele tuturor organismelor vii în proporție de peste 50% din greutatea uscată. Toate proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, în care secvența acestora este codificată de către o genă. Fiecare proteină are secvența ei unică de aminoacizi, determinată de secvența nucleotidică a genei.

Capitolul I Noțiuni generale privind metodele optice de analiză

Aceste metode au la baza utilizarea proprietatilor optice ale substantelor de analizat si interactiunea energiei radiante cu materia.Ele se pot grupa in :

- metode de absorbtie care cuprind: colorimetria si spectrofotometria, ( definite ca metode bazate pe masurarea cantitatii de lumina absorbita de catre particolele unei suspensii ) , nefelometria ( metoda bazata pe masurarea cantitatii de lumina difuzata de catre particulele unei suspensii ).

Ca tehnica de executare metodele de absorbtie pot fi subiective si obievtive.

I.1. Spectrometia: analiza spectrala de emisie ce masoara lungimea de unda si intesitatea radiatiei emise de atomii substantelor aduse in stare de vapori cand sunt excitati cu o energie din exterior

I.2. Fotometria : in flacara la fel pentru excitarea atomilor se utilizeaza o energie mai mica a unei flacari

I.3. Fotoluminiscenta : bazata pe masurarea intensitatii luminii emisa de o substanta sub influenta energiei radiante incidente

I.4. Spectrografie Raman : efectul raman consta in aceea ca lumina monocromatica difuzata de un mediu transparent contine pe langa frecventa luminii incidente si o serii de lumini cu recvente mai mici ( linii Stokes ) precum si o serie de liniii foarte slabe cu frecvente mai mari , dispuse simetric de primele linii anti-Stokes. Spectrul ramun este characteristic molecolelor substantei care produce difuzia

I.5. Alte metode :

a) Refactrometia bazata pe masurarea indecilui de refractie al substantei

b) Polarometria bazata pe studiul rotirii planului de polorizare ( numai pentru substante optic active )

c) Interferometria bazata pe masurarea indecilui de refractie , prin suprapunerea a doua fascicole de lumina monocromatica , provenind de la aceeasi sursa

Capitolul 2. Determinarea proteinelor prin metoda Bradford

Testul de proteine Bradford este o procedură analitică spectroscopică utilizată pentru a măsura concentrația de proteină într-o soluție. Metoda Bradford se bazeaza pe capacitatea proteinelor de a lega colorantul (Coomassie Brilliant Blue G-250 sau Serva Blue G).

Legarea colorantului Coomasie Brilliant Blue la proteină în conditii acide determină o

deplasare a maximului de absorbție de la 465 la 595 nm. Absorbția la 595 nm este

proporțională cu concentrația proteinei. În comparație cu metoda Lowry aceasta metodă utilizează numai un singur reactiv, o soluție acidă de Coomasie Brilliant Blue G-250.

Metoda Bradford poate fi utilizată pentru determinarea concentrației proteinelor în intervalul 1 -

20 µg. Timpul scurt de apariție al culorii (2-5 min) respectiv puținele interferențe (datorate

detergenților) au determinat utilizarea frecventă a acestei metode pentru determinarea

concentrație proteinelor.

Există și situații în care intervin interferențe de la reactivii prezenți în soluție. Lipidele,

agenții cu sulf si EDTAul (agent de chelatare al Cu2+) interferă în cazul în care volumul probei

este relativ mare. În cazul în care concentrația proteinei din proba de analizat este suficient de

mare se preferă o diluție pentru a diminua posibilele interferențe.