Enzimele Imobilizate în Industria Alimentară

I. INTRODUCERE

Enzimele îşi găsesc largi aplicaţii în cele mai diferite ramuri ale activitătii umane: industria alimentară, farmaceutică, la fabricarea hârtiei şi celulozei, industria pielăriei , detergenţilor, etc. În aceste sectoare de activitate au fost introduse noi tehnologii care utilizează preparate de enzime imobilizate.

Prin imobilizarea enzimei se inţelege limitarea gradului de libertate a moleculei proteice, proces care se realizează prin înreţelarea intramoleculară a enzimei cu ajutorul reactivilor bifunctionali sau prin legarea ei covalentă la suport polimer, insolubil în apă.

Enzimele imobilizate prezintă o serie de avantaje care au permis utilizarea lor în biotehnologiile actuale: separarea usoară din amestecul de reacţie, reciclarea catalizatorului, stabilizarea lui. Aceşti biocatalizatori eterogeni permit conducerea continuă a procesului enzimatic în reactoarele cu flux continuu si reglarea vitezei de reactie catalizate fie prin scoaterea din mediu a produsului de reacţie fie prin viteza de curgere. Imobilizarea enzimelor permite şi modificarea controlată a proprietaţilor şi chiar a specificitaţii lor: dependenţa activităţii de pH-ul mediului , stabilitatea faţă de diferiţi agenţi denaturaţi ai mediului, termostabilitatea, selectivitatea si productivitatea acestor biocatalizatori. Pe langă aspectele aplicative, imobilizarea enzimelor a devenit un procedeu de studiu al problemelor fundamentale ale enzimologiei şi biologiei moleculare.

II. METODE DE IMOBILIZARE

Enzimele imobilizate pot fi obţinute prin ataşarea la un suport care este insolubil în soluţii apoase sau care devine insolubil după combinarea cu proteina. În felul acesta se obţine un complex enzimă-suport, insolubil şi activ din punct de vedere catalitic.

Acest complex se poate obţine prin procedee de absorbţie, schimb ionic, formare de legături covalente, legări încrucişate, incluziune şi polimerizare. Reacţia în urma cărora se formează un astfel de complex trebuie realizate în conditii care asigură menţinerea stabilităţii conformaţiei native a enzimei (temperaturi scăzute, pH optim de acţiune ). Suportul nu trebuie să denatureze enzima, trebuie să fie rezistent la modificările de pH sau temperatură si să posede proprietaţi hidrofile. Deoarece nu întotdeauna este posibilă optimizarea acestor condiţii, imobilizarea are un caracter empiric într-un grad mare.

A) Adsorbţia este un procedeu de legare reversibilă a enzimei pe un suport, realizându-se conform principiilor acestui tip de cromatografie. Enzimele pot fi adsorbite ca rezultat al acţiunilor fizice şi ionice pe materiale ceramice, sticlă , silicagel, oxizi si hidroxizi ai metalelor, polizaharide, răsini organice, cei mai folositi adsorbanţi fiind fosfatul de calciu, hidroxilapatita, cărbunele activat, argila, celuloza, sticla şi colodiul.

Pentru mărirea gradului de adsorbţie, uneori enzimele sunt modificate chimic prin introducerea pe suprafaţa globulelor proteice a unor grupări suplimentare, ionice sau hidrofobe. În cadrul acestei tehnici de imobilizare trebuie evitată denaturarea enzimei si “pierderea” ei la desorbţie.

B) Schimbul ionic este un procedeu de imobilizare care se bazează pe caracterul polielectrolitic şi amfoter al proteinelor. În scopul imobilizării se folosesc atât schimbători anionici (DEAE- celuloză, Dowex -2), cât şi schimbători cationici (CM- celuloza, fosfo- celuloza, citrat- celuloza, Dowex -50) La fel ca şi în cazul metodei precedente, schimbând conditiile de sorbţie se poate realiza desorbţia enzimei de pe suport. Dezavantajul ambelor metode prezentate este faptul că enzima se poate disocia usor din complexul enzimă suport.

C) Legarea covalentă constă în reacţia chimică dintre grupările reactive ale suportului cu cele ale enzimei , conducând la imobilizarea ireversibilă a enzimei. Un interes deosebit îl prezintă metodele chimice care permit legarea enzimelor prin grupări funcţionale indiferente pentru cataliză: amino (α sau ε ), imido (de la triptofan) , amido 9 de la asparagina, glutamine), hidroxil 9 de la serina, treonina ),carboxil (α, β sau γ ), tiol ( de la cisteina ), metiltiol (de la metionina ), guanidil (de la arginina ), imidazol 9 de la histidina). Legarea se poate realiza pe suporturi anorganice (sticlă poroasă, materiale ceramice ), pe suporturi naturale ( celuloza, chitina, dextrană, agaroză) sau pe polimeri sintetici (nailon, polistiren, poliacrilamida), prin intermediul unor grupări imidocarbonat, oxiran, azida, diazo, izotiocianat, triazinil, etc

Pentru conferirea unei capacităţi de legare mare, suprafaţa suportului trebuie uneori activată. În cele ce urmează este prezentat un exemplu de imobilizare a unei enzime pe o materie polizaharidică. În prima etapă suportul este oxidat cu periodat de potasiu până la formarea unor grupări carbonil la care se leagă enzima prin punţi azometinice.

În prezent metoda legării covalente este tehnica de imobilizare a enzimelor cel mai des utilizată., deoarece nu prezintă dezavantajele tehnicilor anterioare.

D) Legarea încrucisată este un proces care constă la formarea de legături covalente încrucişate intre difritele catene polipeptidice ale enzimei si suportului. Folosind reactivi cu două sau mai multe grupări funcţionale reactive se realizează legarea încrucişată intermoleculară a moleculelor de enzimă , obţinându-se o reţea tridimensională sau se pot lega moleculele de enzimă cu suport insolubil Agenţii de legare încrucişată utilizaţi cel mai frecvent sunt glutaraldehida şi acidul bis-diazobenzin-2,2’-disulfonic.

E) Incluziunea constă în includerea mecanică, de obicei ireversibilă, a moleculelor de enzimă în suport insolubil În acest caz suportul este gelul de poliacrilamidă, de dextran, amidonul sau membranele semipermeabile. O utilizare largă a cunoscut metoda de includere mecanică a enzimelor în geluri de polimeri, în microcapsule semipermeabile ale polimerilor, în fibre tubulare, în lipozomi etc. În cadrul preparatelor Enzygel, enzima este legată de grupări vinil introduse prin reacţia ei cu un reactiv heterobifuncţional care conţine o grupare vinil şi o grupare care reacţionează cu proteina.