Laborator de Biosecuritate Alimentară

I. Studiu privind prezenta speciei Listeria monocytogenes în lapte si unele produse lactate.

Material si metoda

Izolarea si identificarea speciei Listeria monocytogenes din alimente s-a facut conform standardului ISO 11290-1/2000. S-au testat probe de lapte de vaca atât pasteurizat cât si nepasteurizat, brânza de vaci obtinuta din lapte nepasteurizat, smântâna obtinuta din lapte nepasteurizat, si cas proaspat de oaie. Probele au fost recoltate din sector particular, mai putin probele de lapte pasteurizat care au fost recoltate din comert. (lapte la punga)

Conform schemei de mai jos, pentru preîmbogatire s-au omogenizat 25 grame/ml de produs cu 225 ml bulion demi-Fraser. Dupa o incubare de 24 ore la 300C, a urmat o îmbogatire secundara selectiva prin trecerea a 0,1 ml din cultura de preîmbogatire în 10 ml bulion Fraser. Dupa o alta perioada de incubare la 35-370C, timp de 24 de ore, s-a trecut la izolarea selectiva care s- facut prin strierea a 0,1 ml de cultura pe mediile selective Palcam si Oxford. Placile Petri astfel însamântate s-au incubat la 350C, timp de 24-48 de ore. Din coloniile caracteristice (gri-verzui înconjurate de un halou negru pe mediul Palcam, iar pe Oxford colonii negre înconjurate de halou negru) s-au pasat pe suprafata unui agar nutritiv în vederea efectuarii unor teste de identificare : caracterele morfologice, reactia catalazei, mobilitatea, hemoliza si testul CAMP.

Confirmarea speciei Listeria monocytogenes s-a facut cu ajutorul testelor API- Listeria, în cadrul carora s-au examinat 10 caractere biochimice.

Rezultate si discutii

Frecventa speciei Listeria monocytogenes în produsele examinate a fost urmatoarea : în laptele de vaca nepasteurizat 6,67%, în brânza de vaci obtinuta din lapte nepasteurizat 5%, în smântâna 5%, în cas proaspat de oaie 10%, iar în laptele de vaca pasteurizat nu a fost izolata.

Microflora de asociatie a fost inhibata de substantele componente si de suplimentele celor doua medii, cum ar fi : clorura de litiu, acriflavina, polimixina B, în cazul mediului Palcam, iar în cazul mediului Oxford de clorura de litiu, cicloheximida, sulfat de colistina, acriflavina, cefotetan si fosfomicina. Astfel mediile mai sus mentionate s-au dovedit a fi intens selective. Pe aceste medii dupa 24 de ore de incubare, Listeria monocytogenes formeaza colonii de culoare închisa, înconjurate de un halou negru, datorita faptului ca produce hidroliza esculinei. La examinarea frotiurilor efectuate din culturi si colorate Gram, s-a constatat prezenta unor bacilli scurti Gram-pozitivi, fara a avea o aranjare caracteristica.

Testul catalazei s-a efectuat prin introducerea unei anse de cultura într-o picatura de peroxid de hidrogen 3%. Toate tulpinile cercetate au reactionat pozitiv, aspect dovedit de aparitia bulelor de gaze.

Mobilitatea s-a testat însamântând cu acul drept o coloana de agar moale, care a fost apoi incubata timp de 48 de ore la 250C. Tulpinile testate s-au dovedit a fi mobile aspect evidentiat de dezvoltarea bacteriei sub forma unei umbrele tipice.

Pentru confirmarea si identificarea speciei Listeria monocytogenes, tulpinile care au raspuns pozitiv la testele de mai sus s-au supus si testelor de hemoliza si CAMP, confirmarea definitiva facându-se cu ajutorul testelor API-Listeria.

Concluzii

1. Din analiza rezultatelor obtinute se constata prezenta speciei Listeria monocytogenes în urmatoarele procente : în lapte de vaca nepasteurizat 6,67%, în brânza de vaci obtinuta din lapte nepasteurizat 5%, în smântâna obtinuta din lapte nepasteurizat 5%, iar în casul proaspat de oaie 10%.

2. În laptele de vaca pasteurizat Listeria monocytogenes nu s-a izolat.

3. Metoda utilizata pentru izolarea si identificarea speciei Listeria monocytogenes a avut o rapiditate de 2 pâna la 5 zile, în functie de perioada de îmbogatire, comparativ cu metodele clasice la care aceasta perioada este mai lunga.

4. Identificarea bacteriei s-a realizat cu ajutorul testelor clasice, dar si cu ajutorul testelor Api-Listeria.

5. Diferentierea finala a speciei Listeria monocytogenes de alte specii din cadrul genului s-a facut prin interpretarea testelor Api-Listeria, CAMP si producerea de hemoliza, celelalte teste utilizate pentru identificare nepermitând decât încadrarea bacteriei în genul Listeria

6. Portajul bacteriei în laptele nepasteurizat a fost apropiat de cel al produselor lactate examinate, ceea ce arata o corelatie între laptele nepasteurizat si unele produsele lactate obtinute din lapte integral