Comportamentul celulelor tumorale în hidrogeluri poroase - efectul tehnicii de aplicare și tratamentul cu doxorubicina

Efectul porozității asupra caracteristicilor de difuzie a scaffod-urilor și a capacității invazive a celulelor tumorale MCF-7 și PC-3 a fost studiat pentru hidrogeluri cu gelatină. Conform rezultatelor testelor MTS, eficiența populației unui criogel macroporos de către celule aplicate prin diferite tehnici a crescut în următoarea ordine: migrarea din monostrat <adeziune la suprafață << injecție. Celulele tumorale din criogel diferă de activitatea de migrare și agregare; calea de injectare a asigurat o populație mai uniformă și mai densă. În cultura pe bază de criogel, efectul citotoxic al doxorubicinei a fost cu 3 mai mic decât în cultura monostrat, ceea ce poate fi explicat prin efectul de susținere a scaffold-ului asupra creșterii și aglomerării celulare. Rezultatele sunt de interes pentru crearea de modele tumorale și grefe cu proprietăți controlate.

Crearea de modele informative pentru studiul proprietăților celulelor tumorale și a țesuturilor, detectarea rezistenței lor la medicamente și screeningul medicamentelor anticanceroase este o problemă urgentă a tehnologiilor celulare. Culturile tradiționale de celule de adeziune cultivate pe plastic sunt deseori utilizate în studii fundamentale și aplicate. Se știe că aceste culturi suferă modificări fenotipice semnificative datorită reducerii interacțiunilor celulă - celulă și mai ales celulă - scaffold ceea ce limitează adesea aplicarea lor pentru crearea de modele relevante de tumori umane. O abordare promițătoare este utilizarea unor materiale asemănătoare țesutului constând din componente scaffold-ului extracelular care formează un microambient nativ pentru celulele tumorale. Aceste materiale reprezintă de obicei hidrogeluri macromoleculare reticulate corespunzătoare prin proprietățile fizice și chimice ale țesuturilor moi. Scaffold-urile de hidrogel pentru celulele tumorale au fost dezvoltate pe baza de colagen, fibrină, laminină, acid hialuronic și alte polizaharide, precum și combinațiile lor cu polimeri sintetici. Aceste scaffold-uri diferă prin proprietățile și tehnicile lor de fabricație. Cu toate acestea, hidrogelurile care conțin colagen rămân cele mai populare biomateriale de referință utilizate atât în analiza farmacologică, cât și pentru întărirea potențialului oncogen al celulelor tumorale destinate implantării in vivo. Dezavantajele tipice ale majorității biomaterialelor, derivații extracelulari de scaffold-uri, sunt variabilitatea și anisotropia structurii / proprietăților hidrogelurilor, imunogenitatea potențială a biopolimerilor și hipoxia semnificativă limitând creșterea celulelor vii încorporate și formarea structurilor asemănătoare țesuturilor. Prin urmare, tehnologiile de proiectare a biomaterialelor îmbunătățite, caracterizate prin disponibilitate ridicată pentru celulele de mamifere și care permit controlul efectiv asupra caracteristicilor structurale și reglarea activității celulare a devenit o nouă tendință în acest domeniu.

O „platformă” promițătoare pentru crearea acestor biomateriale sunt criogelurile, adică hidrogeluri cu un sistem bine dezvoltat de pori interconectați care rezultă din criopolimerizare. Studii recente au demonstrat potențial semnificativ de criogeluri cu un singur component și compozit în crearea de scaffold-uri pentru cultivarea celulelor și materiale de inginerie a țesuturilor pentru înlocuirea și regenerarea diferitelor țesuturi. Etapa cheie în crearea de modele de tumori bazate pe criogeluri este dezvoltarea tehnicilor pentru o eficiență eficientă a populației și a urmăririi celulare în biomateriale. Aici comparăm hidrogeluri nonporosi și criogeluri de gelatină ca scaffold-uri pentru tumorile mamare (MCF-7) și celulele epiteliale ale adenocarcinomului de prostată (PC-3) diferind prin adeziunea și proprietățile lor invazive.

Materiale și metode

Fabricarea și caracteristicile hidrogelurilor. Hidrogelurile au fost preparați prin reticularea gelatinei (Sigma-Aldrich) de glutaraldehidă (Acros Organics) într-o soluție apoasă în vasele Petri la diferite concentrații ale componentelor. Pentru prepararea hidrogelului convențional, amestecul de reacție a fost menținut la temperatura camerei până când s-a format material hidrogel stabil (~ 12 ore). Hidrogelul poros (criogel) a fost preparat prin criopolimerizare, adică incubarea amestecului de reacție la -12° C timp de 4 ore într-un termostat de răcire, urmată de depozitarea într-un congelator (-18° C) timp de 24 de ore. Criogelurile rezultate au fost dezghețate și spălate cu PBS steril. Proprietățile de hidratare ale hidrogelilor au fost studiate prin umflarea lor în DMEM (PanEco). În acest scop, membranele materialelor (1 × 1 cm) au fost plasate în mediu (37° C). Probele umflate au fost apoi cântărite pe un bilanț analitic (precizie 0,1 mg). Indicele de umflare pentru probele complet hidratate a fost calculat după formula: SI = (mhyd-mdry) / mdry × 100%, unde mhyd și mdry sunt greutatea probelor hidrogel hidratate și, respectiv.

Condiții de cultivare a celulelor. Celulele MCF-7 și PC-3 (ATCC) au fost cultivate aseptic în DMEM suplimentate cu 10% ser fetal de vițel, 100 U / ml penicilină, 100 pg / ml streptomicină și 2 mM L glutamină (PanEco) în condiții standard (37° C , atmosferă umidificată cu 5% CO2). Pentru subcultură și pregătirea suspensiilor de lucru, celulele au fost disociate folosind trypsină cu EDTA (PanEco), precipitate prin centrifugare și resuspendate în soluția necesară. Pentru cultivarea celulelor cu hidrogeluri, membranele au fost tăiate în epruvete rotunde (grosime 3 mm și diametru 10 mm). Membranele au fost apoi echilibrate cu mediu nutritiv prin incubare într-un volum excesiv de DMEM la 37° C în condiții aseptice și transferate pe plăcile de cultură. Evaluare comparativă a migrației celulare în hidrogel. Membranele au fost plasate într-o placă cu 12 godeuri și s-a adăugat un mediu DMEM cu ser la un nivel de 1 mm sub suprafața superioară a hidrogelului. O alicot de suspensie celulară în DMEM fără ser (10.000 celule) a fost aplicată pe membrană și cultivată timp de 6 ore în condiții standard. Hidrogelii s-au spălat cu PBS, s-au incubat în soluție de 4% de p-formaldehidă în PBS (Acros Organics) timp de 2,5 ore și s-au spălat complet. Celulele fixe au fost colorate cu colorant nuclear DAPI (Sigma Aldrich) și vizualizate sub un microscop confocal cu scanare laser LSM 780 (Carl Zeiss).