L-Asparaginaza

• Obţinerea proteinelor terapeutice = una din cele mai importante direcţii de dezvoltare a biotehnologiei moderne.

• În principiu, utilizarea în terapie a proteinelor se impune în cazurile în care este necesară asigurarea unui grad înalt de specificitate a interacţiunii cu ţinta, deseori cuplată cu necesitatea unei activităţi biocatalitice la un nivel care nu poate fi atins de molecule sintetizate chimic.

Prezentare generala

• L-asparaginaza = exemplu foarte elocvent referitor la avantajele şi limitele aplicării proteinelor în terapia umană.

• Scurt istoric:

- în urmă cu aproximativ 50 de ani s-a observat inhibarea limfoamelor murinice prin injectare cu ser de cobai;

- 10 ani mai târziu s-a dovedit că L-asparaginaza izolată din serul de cobai este factorul activ, responsabil de efectul antitumoral al acestuia;

- în 1967 s-au efectuat primele teste clinice preliminare care au demonstrat importanţa L-asparaginazei în tratamentul leucemiei limfoblastice acute (ALL).

- de atunci şi până în prezent L-asparaginaza a rămas în atenţia cercetătorilor, încercându-se obţinerea acestei enzime într-un grad de puritate cât mai avansat, compatibil cu utilizarea acesteia în chimioterapia anumitor forme de leucemie.

Mecanism de actiune

• Eficienţa tratamentului cu L-asparaginază rezultă din depleţia rapidă şi completă a L-asparaginei din circulaţie, fapt datorat proprietăţii enzimei de a hidroliza L-asparagina la acid L-aspartic şi amoniac.

• Depleţia L-asparaginei circulante are ca urmare inhibarea sintezei proteice la nivelul celulelor maligne, în special al celor limfoide, care sunt incapabile de a-şi sitetiza singure acest aminoacid, fiind dependente de L-asparagina exogenă.

Proprietăţi fizico-chimice şi biochimice ale L-asparaginazei

• L-asparginaza = enzima din clasa hidrolazelor, subclasa amidohidrolazelor, ce catalizează hidroliza grupei amida din structura L-asparginei, care astfel se transforma în acid L-aspartic şi amoniac.

• Masa moleculară: 141.000 daltoni

• Compoziţie: tetramer

• Constanta Michaelis: KM = 1,25 x 10-5

• Punct izoelectric: pH = 4,9

• Specificitate: enzima purificată prezintă 2-4 % activitate faţă de glutamină şi faţă de D-asparagină, raportat la acţiunea sa faţă de derivaţi sau analogi ai L-asparaginei.

• Inhibitori: 5-diazo-4-oxo-L-norvalina (DONV); acest compus este şi un substrat alternativ pentru enzimă.

Tehnologii de obtinere a L-asparaginazei

• L-asparaginaza este un agent antineoplazic utilizat în mod curent în tratamentul leucemiilor limfoblastice acute (ALL), mai des pediatrie.

• Specificul acţiunii terapeutice a L-asparaginazei utilizate în medicaţii complexe impune un grad avansat de puritate a enzimei, ca principiu activ din forme farmaceutice injectabile, grad de puritate care se exprima prin activitatea enzimatică specifică, dar şi prin lipsa pirogenilor şi a antigenilor.

• Utilizarea terapeutica a acestei enzime de impune atât conducerea adecvată a procesului de biosinteză cât şi aplicarea unor metode eficiente de izolare şi purificare a enzimei native.

Factori ce influenţează biosinteza microbiana a L-asparaginazei

• Printre factorii importanţi care influenţează procesul de biosinteză a L-asparaginazei se numară:

- tulpina microbiana

- temperatura

- pH-ul

- transferul de oxigen

- compozitia mediului de cultura

- stadiul de creştere microbiana

Tulpini microbiene producatoare de L-asparaginaza

• Bacterii: E. coli, Erwinia carotovora, Erwinia chrysantemi, Erwinia aroideae, Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Wolinella succinogenes, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiela aerogenes, Seratia sp.

• Fungi: Cladosporium cladosporoides

• Drojdii: Saccharomyces cerevisiae