Metode și Tehnici de Studiu Utilizate în Investigațiile Genetice Biomedicale

METODE

calitative sau cantitative

Tipuri de probe biologice

• Fluide ale organismului

(urină, sânge, plasmă, ser, lcr)

• Celule separate din sânge

• Fragmente sau lizate

tisulare (creier, muşchi,

lichid amniotic, vilozităţi

coriale, ş.a.)

• Culturi celulare normale

(fibroblaste)

• Culturi celulare imortale

(celulele HeLA)

• met de microscopie optica, electronica,

microscopie de forta atomica (AFM)

• met biochimice de separare – analiza de

markeri biochimici

• met de biol. molec.- studiul ADN-ului,

proteinelor, ARN-ului

Met. de microscopie optică

Microscopia optică cu

contrast de fază

examinarea celulelor vii

Microscopia

optică de tip

clasic, coloraţii

histochimice

Microscopia optică (MO) de fluorescenţă

- util. fluorocromi (ex. f. natural: clorofila)

- identif. unor structuri specifice (proteine, acizi nucleici)

Coroplaste cu

clorofilă, exam. MO

Coroplaste cu clorofilă, exam.

MO cu fluorescenţă

Combinarea mai multor

fluorocromi pt. identificarea

concomitentă a mai multor

structuri celulare

– Fluorescence in situ

hybridization (FISH) –

utilizează sonde

oligonucleotidice marcate

cu fluorocromi care se

ataşează de secvenţele

de ADN complementare

(cele de studiat)

Apl: in detectarea unor

modif. punctiforme,

microdeleţii,

modif. legate de

metilarea unor secv. cu

importanţă în epigenetică

MO de fluorescenţă

Microscopia electronică- util. electroni în locul

luminii ca radiaţie incidentă

• 1. De baleiaj (scanning

electron microscopy, SEM)

- se stud. detalii ale

suprafeţelor unor

structuri celulare

Bacterii, SEM

Virus, SEM

• Imaginea unor cili din epit.

resp. (SEM)

• 2. Microscopia de

transmisie (TEM) - se obs.

detalii din int. celulelor

Diagnosticul unor boli genetice în care mutaţiile

afectează proteine structurale (ex: dineina din int cililor);

lipsa dineinei în sindromul cililor imobili

3. Criofracturarea şi analiza prin TEM

- investigarea unor componente membranare

Microscopia de forţă atomică (MFA)

util. un fascicul laser care scanează suprafaţa probei

biol.; detectorul înreg. undele receptate de o fotodiodă

Avantaje faţă de ME

• Analiză 3D a suprafeţelor

• Poate oferi o rezoluţie mai mare decât

SEM

• Nu necesită prelucrare înaintea

examinării (modif. probelor);

• permite examinarea în aer sau lichide,

organisme vii

• Preţul de cost – mai mic decît pt ME

• Permite manipularea biomoleculelor (ex.

cromatina)

Dezavantaje faţă de ME

- S analizată: mică în comp.

cu SEM (150/150 μm2)

-Timpul de analiza este mai

lung, detriorare termică a

probei..apariţia artefactelor

SEM, celule sanguine

imag.

nucleosom prin

AFM

imag. trombocit

prin AFM

Studii biochimice asociate sau nu celor microscopice

Studiile biochimice sau moleculare ale componentelor nucleare (ex studiul ADN)

sau ale organitelor celulare (mitocondrii, lisosomi, reticul endoplasmic, etc) sunt

posibile doar după izolarea prin centrifugare diferenţială